间接ELISA检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体方法的建立.pdf

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1、·202·经验交流中国畜牧兽医2010年第37卷第1期间接ELISA检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体方法的建立李富祥，杨斌。，常志顺，王传禹，姚俊，刘艳丽，李华春(1．云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明650224；2．云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，昆明650224)摘要：应用1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)超声粉碎物作为包被抗原，建立检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的间接ELISA方法。用倍比稀释法确定HRP标记羊抗鸭二抗最佳稀释倍数为1：3500，并用棋盘测定法确定抗原的最佳包被浓度为2．7mg／mL，血清最佳稀释倍数为1：300，阴性血清临

2、界值为0．381；阻断试验结果表明，1型鸭疫里默氏杆菌与其抗血清阻断阳性，与鸭大肠杆菌078、O132菌株和FJ4型鸭疫里默氏杆菌阻断阴性(无交叉反应)。重复性试验结果表明，该ELISA方法批内变异系数≤O．246，批间变易系数≤0．889。结果表明，该ELISA方法特异性强，重复性好，可用于1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)血清抗体的检测。关键词：鸭疫里默氏杆菌；EusA；血清抗体；ELISA效价中图分类号：TQ925．2文献标识码：A文章编号：1671—7236(2010)O1—0202—04鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipesti

3、r，FJ4型RA(福建4型，RA一36云南株)；大肠杆菌RA)病，又称鸭疫巴氏杆菌病、鸭败血症、鸭疫综合O132(DE一148云南株)、O78(DE一198云南株)均由症、鸭传染性浆膜炎，临床以纤维素性心包炎、肝周云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所分离、鉴炎、气囊炎和脑膜炎为特征，该病分布范围广，发病定和保存。率、死亡率高，是目前危害各国养鸭业最为严重的传1．2主要试剂及仪器HRP标记羊抗兔IgG购自染病之一(苏敬良等，2005)。其病原菌鸭疫里默氏美国Kpl公司；TMB底物购自上海生工生物工程杆菌血清型众多，国外报道已经存在21个血清型有限公

4、司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公(Pathanasophon等，1995，2002)，各个血清型之间司；96孔酶标板购自Costar公司；Emax酶标仪购不存在交叉免疫保护或仅存在微弱交叉免疫保护，自美国利奥沃德科技公司；超声波细胞粉碎机中国自从郭玉璞等(1982)首次报道了在北京地区发(JY92—2D)购自宁波新芝生物科技股份有限公司。现本病，并分离出病原菌，随后广东、浙江、福建、四1．3试验动物8日龄雏鸭(北京鸭)购自昆明某川、江苏等省区也陆续发现本病，云南也于1993年鸭场。发现本病，并分离了200余株鸭疫里默氏杆菌，其中2方

5、法1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)为云南主要流行的血2．1ELISA包被抗原的制备参考方鹏飞等清型，中国是世界第一养鸭大国，根据．FAO的数据(2002)介绍的方法，稍加改进。用灭菌生理盐水将统计，2005年中国鸭存栏量超过7．25亿只，占世界培养的菌落洗下来，5000r／min离心5min弃上清，总存栏量的72左右，中国养鸭工业的发展将对世用生理盐水重悬沉淀再离心，重复以上步骤将菌体界养鸭业产生深远的影响。因此，建立其间接洗涤3次。用生理盐水将菌液浓度调整至3．7×ELISA检测血清抗体的方法对鸭疫里默氏杆菌病10CFU／mL，取20mL菌液用超声

6、波细胞破碎机的诊断、流行病学调查和疫苗免疫效果的评估具有4oC间断超声7s／次，间隔10S，共超声50次，功率重要意义。为9OW。4000r／min离心10min取上清即为1材料ELISA包被抗原，用BCA法测定其蛋白浓度(汪家1．1菌株血清1型RA(RA-8云南株)和血清政等，2000)，一20℃保存备用。2．2参考血清的制备①阳性血清的制备：用自制收稿日期：2009—09—01的1型RA灭活油苗颈部皮下注射8日龄雏鸭，1作者简介：李富祥(1979一)，男，云南人，助理研究员，主要从事mL／只，注射后5周采血分离血清，一20℃保存备动物微生物及

7、免疫学研究。用。②阴性血清的制备：未接种过任何疫苗的8日通信作者：李华春，研究员，主要从事动物病毒学研究。E-mail：huachun龄雏鸭(其父母代鸭也均未免接种过鸭疫病里默氏_li@hotmail．corn基金项目：科研院所技术开发研究专项(2007CF009)。杆菌疫苗)单独饲养5周后采血分离血清一2O℃保中国畜牧兽医2010年第37卷第1期经验交流·203·存备用。D值，计算其平均值和标准差，以平均值加上22．3间接ELISA操作程序按常规间接ELISA倍标准差作为阴性血清的临界值。方法：①抗原包被：将制备的包被抗原用包被缓冲液2．7EL

8、ISA结果判定以D。值大于阴性血清(O．05mol／L碳酸盐缓冲液，pH9．6)适度稀释后，的临界值判定为阳性，以D。值大于阴性血清临每