DB 37T 3127—2018 禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范

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1、ICS 11.220B41     DB37山东省地方标准DB37/T3127—2018     禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范TechnicalGuidelineofAgglutinationTestandIndirectELISAforAntibodyDetectionofBordetellaavium2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局   发布DB37/T3127—2018前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学

2、、山东省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏。7DB37/T3127—2018禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范1　范围本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备，利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测禽波氏杆菌抗体的方法和技术要求。本规范适用于禽场禽波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（

3、包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T603　化学试剂　试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB14925　实验动物　环境及设施3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　禽波氏杆菌　Bordetellaavium,B.avium是波氏杆菌属（ThegenusBordetella）四个种中的一个新种，1984年由Kersters确认。3.2　试管凝集试验　tubeagglutinationtest常用已知已定量的抗原与一系列稀释的禽的血清混合，在保温放置后观察结果，以判定受检血清有无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。3.3　间接酶联免疫

4、吸附实验　indirectenzyme-linkedimmunosorbentassay,iELISAELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。iELISA是基于ELISA反应原理设计的，包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。4　试剂或材料4.1　禽波氏杆菌标准株7DB37/T3127—2018禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。1.1　禽波氏杆菌阳性血清SPF鸡经免疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清，每次免疫间隔两周。1.2　阴性血清从SPF鸡分离的血清。1.3　待检禽血清采集禽的血液，于37℃

5、温箱中静置2h，收集析出的血清。1.4　生化试剂灭菌0.5%石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCl、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配制方法见附录A）。2　仪器设备2.1　平板（玻板、白瓷板或载玻片）。2.2　微量移液器：量程为20μL～100μL。2.3　接种环。2.4　试管架。2.5　小试管（口径8mm～10mm）。2.6　灭菌吸管（1mL）。2.7　恒温培养箱。2.8　匀速振荡器。2.9　96孔ELISA酶标板。2.10　酶标仪（波长范围340nm～850nm）。3　禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验3.1　用20μL微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌P5株标准抗原于平板

6、上。3.2　再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混合均匀，3min～5min观察结果。3.3　平板凝集试验可参考图1：7DB37/T3127—2018图1　平板凝集试验图示1.1　结果判定：6.4.1阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，阴性血清与阳性抗原作用后仍均匀混浊，试验结果有效。6.4.2待检禽血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，则判为阳性。6.4.3待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。6.4.4待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间，判为可疑。2　禽波氏杆菌抗体检测试管凝集试验2.1　被检禽血清稀释度设定通常情况下，

7、用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度；大规模检疫时，可只用前两个稀释度。2.2　血清的稀释及抗原的加入2.2.1　血清的稀释2.2.1.1　为每份血清准备小试管5支，第一管加入2.3mL石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、五管各加入0.5mL石炭酸生理盐水。2.2.1.2　用1mL吸管吸取被检血清0.2mL，加入第一管中，并混合均匀，然后用吸管吸取混合液0.5 mL，加入到第二管中，混合均