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1、等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中应用【摘要】目的：采用等位基因特异性PCR法对ACE基因多态性进行检测，并对脑血管疾病（CVD）与ACE基因多态性的相关性进行探讨。方法：将2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族共73例CVD患者（CVD组）和43例健康人员（对照组）进行ACE基因多态性检测，并对结果进行分析。结果：116例受检人员均获得扩增产物，CVD组患者73例扩增产物中，DD型14例（19.2%）,II型30例，ID型29例；对照组43例扩增产物中，DD型5例（11.6%）,II型19例，ID型19例，对照组中DD型基因频率低于CVD组，差异无统
2、计学意义（P>0.05）。结论：等位基因特异性PCR检测技术可对ACE基因多态性进行有效检测，对于CVD的防治具有重要的参考意义。【关键词】等位基因特异性PCR；脑血管疾病；ACE基因多态性中图分类号R743文献标识码B文章编号1674-6805（2013）34-0042-02脑血管疾病（cerebrovasculardisease,CVD）由脑血管病变所引起，主要高发于65岁以上人群，患者发病后易残留后遗症，导致劳动和生活能力丧失，也是人类死亡的重要原因之一。CVD主要分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病，其中以缺血性为多见。CVD的产生由遗传因素和环境因素共同作用所引
3、起，髙血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病是CVD发生的首要高危因素［1］,而血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性与高血压等心血管疾病的发生有关［2］。笔者选择等位基因特异性PCR技术对云南景颇族和傣族73例CVD患者的ACE基因多态性进行检测，以期为ACE基因多态性与CVD的相关性提供临床依据，现将结果报道如下。1资料与方法1.1一般资料选取2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族46例健康人员（对照组）和73例CVD患者（CVD组），取早晨空腹静脉血10ml,肝素抗凝后离心分离血浆，采用酚抽提法抽提患者外周血白细胞DNA模板,所有受检人员无血缘关系。1.2试剂与仪
4、器DNA提取试剂选用天根DP-318DNA提取试剂盒；Taqmaster等PCR反应试剂购自天根生化科技有限公司；引物由捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，ACE-F,5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3',ACE-R,5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3'；PCR仪选用Icyclertmthermalcycler（美国Bio-RAD公司）；微量核酸蛋白定量仪选用ND~1000UV/Vis（美国NanoDrop公司）；凝胶成像系统选用UniversalHoodll（美国Bio-RAD公司）。1.3方法1.3.1模板DNA提取在
5、全血样品中加入Prok20»1,完全混合、离心，再加入GB200ul,离心后加无水乙醇，充分混合后过柱，弃滤液，加入TB50n1,过柱后回收TB定量，并对DNA样品进行含量检测。1.3.2PCR反应体系和反应条件扩增体系：ACE-F或ACE-R引物1.5Hl,H207.5n1（样品），2XTaq-master10Pl,DNA样品1uloPCR扩增条件：94°CX4min预变性，94°CX30s变性，67°CX30s退火，72°CX30s延伸，共28〜31个循环，72°CX4min延伸后保存。采用凝胶成像系统对扩增产物进行分析，所有样品的PCR实验以及电泳分析均重复两次以
6、上以对结果进行验证。1.4统计学处理采用SPSS13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数土标准差（x土s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（％）表示，等位基因频率差异采用字2检验，P0.05）,所有样品均经两次以上PCR及电泳验证，条带均清晰且结果一致（图1）。DL2000490bp（II型）190bp（DD型）（ID型）100bpDNALadder图1ACE基因多态性等位基因特异性PCR检测结果3讨论脑血管疾病(CVD)是65岁以上人群的常见疾病，当患者脑部出现梗阻性缺血时即发生缺血性CVD,而当脑部血管发生破裂时则为出血性CVD,患者易致残致死，丧失工作
7、或生活能力，危险性极高［3］。有研究表明，脑血管疾病的发生与高血压、高血脂、高血糖、冠心病等心血管疾病密切相关，而ACE基因中由Alu重复序列的存在或缺失的三种基因型(缺失纯合子DD,插入纯合子II,杂合子ID)与心血管疾病的发生有关［4］。因此，鉴于CVD的高发性和危害性，ACE基因多态性的检测对于CVD疾病的防治具有重要的意义。在本次研究中，116例受检人员均成功得到扩增产物，且经验证结果一致。在CVD组73例患者的扩增产物中，DD型14例，基因频率19.2%；对照组43例患者的扩增产物中，DD型5例，基因频率11.6%,明显低于CV
