page）、凝胶染色与扫描

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1、实验十四分子毒理基础实验－蛋白质的电泳（SDS—PAGE）、凝胶染色与扫描一、目的与要求1、掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生物大分子的原理。2、学会测定蛋白质大分子生物量。3、了解蛋白凝胶染色、脱色与扫描过程的操作方法及注意事项。二、实验原理离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子间只保持着分子大小的差异，彼此间原有的电荷差异被消除或大大降低。当SDS被引入聚丙烯酰胺凝胶系统并进行电泳时，样

2、品中蛋白质原有的电荷差异已不起作用，蛋白质分子在电场中的迁移速度仅取决于各自分子的大小，从而得到分离。SDS与蛋白质按重量比的关系进行结合。当SDS浓度大于1时，大多数蛋白质和SDS的结合比例为1.4SDS：1蛋白质。当蛋白质相对分子质量在时，蛋白质的迁移率和相对分子质量的对数呈直线关系。将已经相对分子质量的标准蛋白的迁移率对其相对分子质量的对数作图时，可得到一条标准曲线。此时，将未知相对分子质量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，就可根据此蛋白质的电泳迁移率，在标准曲线上查得它的相对分子质量。用考马斯亮蓝（CBB

3、）对十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶进行染色，然后快速脱色，常用混合床树脂或其它材料来吸附从染色凝胶扩散出来的游离染料。对脱色凝胶进行扫描，其中吸光值与结合染料的量成正比。三、试剂与器材1、试剂(1)标准蛋白质标准蛋白质相对分子质量细胞色素c12500胰凝乳蛋白酶原A25000胃蛋白酶35000卵白蛋白43000牛血清白蛋白67000（２）0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L磷酸二氢钠日用280ml，加入0.2mol/L磷酸氢二钠溶液720ml，混匀后在pH计上调至pH7.2。（３）样品溶解液0.

4、01mol/L、pH7.2磷酸缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。SDS100mg，巯基乙醇0.1ml，甘油1ml，溴酚蓝2mg，0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液0.5ml。加蒸馏水至总体积10ml。（４）电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/L、pH7.2磷酸缓冲液。取1gSDS，加入500ml0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容1000ml。（５）染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入50%甲醇水溶液454ml和

5、冰乙酸46ml。（６）脱色液：75ml冰乙酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。2、器材（１）电泳槽：垂直电泳槽（２）凝胶电泳玻璃管：内径5-6mm，外径7-8mm，长100mm，两端用金刚砂磨平。（３）小玻塞：将与凝胶玻璃管直径相同的玻璃棒，截成约长，两端磨平。同时以乳胶管与凝胶玻璃管相连。（４）1ml、5ml、10ml注射器；50ul或100ul微量注射器（５）凝胶扫描装置四、操作步骤1、贮液及凝胶溶液的配制贮液20凝胶溶液混合比5%凝胶10%凝胶IAcr30g凝胶贮液Bis0.8g3.33ml6.67ml加蒸

6、馏水到100mlII凝胶缓冲液SDS0.2g10ml10ml0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液500mlIIITEMED2ml2ml20ul20ul蒸馏水4.57ml1.23mlIV100过硫酸铵以上溶液混合后抽气1010min0.1ml0.1ml注：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺TEMED：N，N，N，’N’-四甲基乙二胺。2、样品制备标准蛋白质样品称取细胞色素c、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵白蛋白、牛血清白蛋白各0.2mg左右，分别放入小试管中，按0.5mg蛋白质/1ml溶液的比例，向样品中加入“

7、样品溶解液”使充分溶解，盖上软木塞（不要塞紧，以免加热时迸出），将小试管放入沸水中加热3min后，取出冷至室温。待测蛋白质样品配制“样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高一倍），将待测液与“样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。处理好的样品溶液即可用于电泳。直径为6mm的凝胶柱，每管加10ug蛋白质可得到清晰的区带。根据样品溶液的浓度，加样体积可为10-150ul。3、电泳轻轻取小凝胶管的小玻塞，注意保护垂直装置在电泳槽上。将电泳槽的上槽倾斜过来，使凝胶管口斜向下方，用滴管轻轻吸去流到凝胶管口的水。将电极缓

8、冲液注入小槽，将上槽轻轻放下，稍转动，以除去凝胶管底部可能有的小气泡，也可用带弯头的滴管轻轻吸去。将电极缓冲液注入上槽，没过管口。用微量注射器按号向凝胶管中加样，每管加一种样品，各加20ul。加样完毕，打开直流稳压电源，将电流调至每管8mA。保持电流强度不变，待染料迁移至距下口约1cm处，停止电泳。4、染色、脱色用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水