dna脱甲基化对整合至rdna区外源基因hfⅷ表达量影响

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1、硕士学位论文中文摘要摘要DNA甲基化作为一种基因表达调节机制，在许多生物学过程中扮演着重要的角色，包括胚胎发育、遗传印记、细胞分化和肿瘤发生等。pHrneo是被我室构建的一种人类核糖体DNA打靶载体。它能靶向外源基因到人类核糖体DNA区。由pHrneo携带的外源基因能稳定地在多种细胞中表达，包括HL7702(人类肝细胞)和HTl080(人类纤维肉瘤细胞)，但是，其表达效率有待于进一步提高。影响定点整合目的基因表达的因素可能有多种，包括目的基因的拷贝数、DNA甲基化修饰、组蛋白的乙酰化修饰等。这里我

2、们从DNA甲基化修饰的角度，探究其对定点整合目的基因表达的影响。目的：通过比较脱甲基化药物5一aza_2’一deoxycytidine处理组和对照组定点整合克隆细胞株目的基因人凝血因子Ⅷ的表达情况，以及目的基因CMv启动子区甲基化情况，研究DNA甲基化对目的基因表达的影响。方法：我们选择三种不同浓度的脱甲基化药物5一aza_2’一deoxycitidine_州、lO州、20P射I，分别对pHrneoSK39—25细胞株处理72小时和120小时，同时以未加脱甲基化药物处理的定点整合克隆细胞株、脱甲基

3、化药物处理的HTl080细胞株和相同条件下未处理细胞的同浓度的脱甲基化药物为对照组。收集各组细胞上清，通过ELISA检测各组hFⅧ的表达情况。此外，用重亚硫酸盐测序PCR，确定CMV启动子区的甲基化状态。结果：ELISA检测各组目的基因表达情况显示，用5-aza-硕士学位论文中文摘要2’一deoxycytidine处理72小时和120小时的细胞，hFⅧ的表达量分别是未加脱甲基化药物处理对照组的5倍和10倍。重亚硫酸盐测序PCR的结果显示目的基因CMV启动子区未发现有甲基化位点。结论：DNA甲基化修

4、饰对定点整合目的基因的表达有较大影响，但是这种影响可能并非由目的基因启动子区异常甲基化引起的。我们推测rDNA区脱甲基化引起染色质结构变化可能是造成这一结果的原因。关键词DNA甲基化，人凝血因子Ⅷ，ELISA，pHrneoⅡ硕士学位论文英文摘要ABSTRACTAsakindofgeneexpressionregulationmechanism,DNAmethylationplayallimportantroleinmanybiologyprocesses，includingembryonicdev

5、elopment，geneticimprinting，celldifferentiation，tumorigenesisandSOon．pHrneo，ahumanribosomalDNA—targetingvectordevelopedbyOI／17group，CantargetexogenousgenetohumanribosomalDNAlocus．TheexogenousgenescardedbypHrneocouldstablyexpressinsomecelllines，suchasHL

6、7702(humanhepatocyte)andHTl080(humanfibrosarcoma)．ButtheadvancedefficiencyofexpressionisstillOUraim．Thefactorsaffectinginterestedsite-directedintegrationgeneexpressionmayinvolvecopynumbersofinterestedgene，DNAmethylationmodification，histoneacetylationm

7、odificationandSOon．Inthisstudy,ourfocusisontherelationbetweeninterestedsite-directedintegrationgeneexpressionandDNAmethlationObjects：Inthisresearch，weinvestigatedtherelationbetweeninterestedsite—directedintegrationgeneexpressionandDNAmethlationmodific

8、ationbycomparinghumancoagulationfactorFⅧexpressionlevelofsite—directedintegrationcellbetweendemethylationagent5一aza一2'-deoxycytidinetreatmentgroupandcontrolgroup，andthemethylationpattemofinterestedgenepromoter．Methods：Threeconcentrationsof5一az