钙激活酶激活因子（uk114）嫩化肉的研究及其cdna克隆和表达载体构建

《钙激活酶激活因子（uk114）嫩化肉的研究及其cdna克隆和表达载体构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中国农业人学博Ij学位论史(20026)摘要肉的嫩度是肉类品质鉴定的重要指标，提高肉的嫩度一直是肉类l。业的重要研究课题。钙激活酶系统(calpains)是动物宰后导致肌肉嫩化的重要酶系统，钙激活酶激活冈子(caJpainac￡jva￡or)是钙激活酶(caJpajn)的激活蚩冈子，是caJpain的止调协网子。但是，目前天r该激活蛋白的研究还很少。本论文对uKll4的肉嫩化作用进行了研究，构建了山羊肝脏cDNA文库，根据colombo等1998(colomboeta1．，1998)报道的uKll4的cDNA序列克隆了calpainac

2、tivatorcDNA，进行了序列测定，行构建了人肠杆菌表达载体，同时也对该表达载体进行了鉴定。㈠．uKll4嫩化牛肉的研究表明：宰后1小时，注射3％的8mMuKll4可以显著地降低牛肉的剪切力，宰后1天牛肉的嫩度就有明显的提高，2天时完成成熟。2．uKll4处理肉导致肌肉肌原纤维小片化指数升高，使肌原纤维z。线断裂，从而促进肉的嫩化。3．山羊肝脏总RNA的提取：_Hj组织匀浆器破碎组织，JL}jProme2a『总RNA提取试剂盒提取总RNA，经甲醛凝胶电泳检测，有明显的28srRNA和18srRNA条带。4．山羊肝脏mRNA的提取：用

3、安发玛西亚生物技术公司mRNA提取试剂盒提取山羊肝脏mRNA，mRNA的得率为l一5ug，o．19材料，mRNA的浓度为19．52ug，ml，经甲醛凝胶电泳检测，mRNA分布于500bp到3kb之间。5．用安发玛西弧生物技术公司cDNA合成试剂盒、Prome2ar公司噬菌体包装蛋白等试剂盒构建了克隆于^昏10的非表达型cDNA文库，所构建cDNA文库的滴度2．6×106p叫mI，经琼脂糖凝胶电泳检测，cDNA插入片段大于1kb。6．PcR扩增calpainactivatorcDNA：采用平板裂解物法提取噬菌体DNA作为模板，根据uKll

4、4的cDNA序列设计了一对引物：引物1(5‘)：5—gaccatggcat豇cttctttga一3和引物2(3)：5一gaggatccaatctgcatgctamcatttcca一3，经PcR获得了一个长度约为1kb的cDNA片段。7．calpainactivatorcDNA的克隆与序列分析：用常规基因克隆技术把calpainactivalorcDNA基因经^一T连接插入pGEM—T克隆载体，进行测序和序列分析。结果表明，该序列全常泓：¨激活酶激活协I子(uKll4)肉嫩化的研究及，#cDNA的克降‘j表达载体的构吐K1()17bp，f

5、r个丌放的阅读框(40nt450nt)，¨J编码137个氨基酸(14．2kDa)。calDamactivatorcDNA‘JuKll4的序列比较．同源性为91％，突变的86个核越：酸中都为尤义突变，开放阅读框中仪仃～个核茁=酸突变。将克隆的calpainactivatorcDNA推导的氮丛酸序列‘JMeJlonjeI，a

6、1998年报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蚩门的氯基酸序列比较㈨游’陀为98％。8．calpajnactjVatorcDNA表达载体的佝建：_L}jBamHI和Nco1分别酶切rcR，虹物和pBV221质粒载体，同

7、收小片段，然后把它们连接起来，构建得到DBv221uKll4(简称pBvl14)表达载体。9．calpainactiVtorcDNA表达载体的鉴定：将质粒pBvll4转染BL21(DE3)感受态细胞，选抒日{性克隆提取质粒进行酶切，琼脂糖检测获得约1kb和3．7kb的两个片段。犬键诃：钙激活酶馓活网子uKll4嫩化克隆表达载体中国农业人学博士学位论史(20026)Abstract7I、hetendemessofmeatisanimponantindextoapprajsethequalityofmeatToimproVeIhetende

8、messofmeatjsalwaysimportantforstudyinmeatindustryThecalpainproteaSesystemisthoughttoplayanimportantroleinthepostmortemtende“zationofmeatThecalpainactivatorjsaproteinlhatsmnuJalestheactjvitiesofca

9、pajns．AJfhou曲jtislheposjtjvefac￡orofcalpain’studiesofthjscalpa{nactivatorha

10、vebeenscarceFirstly，westudiedthee仃ectsofUKll4onmeattendemess．Secondly，weconstructedthegoatliVercDNAlibr