异种同源kdr+mrna修饰dcs诱发抗肝肿瘤血管免疫的分析

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1、第三军医大学硕士学位论文1材料和方法1．1实验材料I．1．1主要试剂。(1)质粒提取、回收试剂盒：上海华舜生物工程有限公司，中国(2)BamHI、BgllI等各种限制性内切酶：TaKaRa公司，日本(3)T4DNA连接酶(1igase)：TaKaRa公司，日本(4)琼脂糖(agarose)：GIBCO公司，德国(5)RPMll640培养基干粉；GIBcO公司，德国(6)10％胎牛血清：Hyclone公司，美国(7)MEGAscriptSP6高产量mRNA体外转录试剂盒：Ambion公司，美国(8)RNAmarkers：Promega公司

2、，美国(9)转化试剂盒：华美生物工程公司，中国(10)DNAmarkers：华美生物工程公司，中国(11)T4DNA连接酶(1igase)；TaKaRa公司，日本(12)G418：华美生物工程公司，中国(13)十二烷基硫酸钠(SDS)：Biomol公司，美国(1d)二甲基亚砜：Sigma公司，美国(15)焦磷酸二已酯(DEPC)：AMRESCO公司，美国(16)脂质体转染试剂盒：Roche公司，美国(17)溴化乙啶(EB)：Sigma公司，美国(18)脂多糖(LPS)：Sigma公司，美国(19)粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子(GM．CS

3、F)：PeproTech公司，英国(20)细胞毒性分析试剂盒(CytoTox96@Non-RadicativeCytotoxicityAssayKit)：Promega公司，美国(21)ILl．9032DAB免疫组化试剂盒：中杉公司，中国(22)各种流式细胞仪抗体：B．D．公司，美国(23)乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA·2H20)：重庆华工总厂，中国(24)Yris饱和酚：TBD生物公司，中国1．1．2主要质粒、细胞系及动物(1)hKDR和mKDR由本实验室克隆，并插入载体pcDNA3．1()中；体外转录mRNA的模板质粒pmRN

4、AIRESLuc由本实验室构建。7第三军医大学硕七学位论文(2)小鼠Hepal．6肝癌细胞系由本实验室冻存。(3)C57BL／6小鼠，4-6周(18+2)g，雌性，购白北京中国医学科学院动物研究所，在无菌环境中饲养。1．1．3主要仪器倒置显微镜OLYMPS公司Kodak凝胶成像仪Kodak公司紫外分光光度仪LKB公司PCR仪Promega公司高速冷冻离心机Heraus公司C02细胞培养箱ALSCO．200流式细胞仪Bio．Rad公司酶标仪SAl000Asys公司培养瓶、培养皿Falcon公司6孔和96孔培养板Falcon公司电泳装置中国

5、大连高压灭菌器中国上海1．1．4主要试剂配置(1)1MTris．CI(PH7．4、PH7．6、PH8．O)Tris碱121．19浓HCL70ml／60ml／42ml定容至lL，即为PH7．4／7．6／8．0的1MTris．CL(2)0．5MEDTA(PH8．0)Na2EDTA·2H20186．19NaOH调PH为8．0定容至1L(3)10×TE(PH7．4／7．6／8．0)"Iris．CI(PH7．4／7．6／8．0)10ml0．5MEDTA定容至100ml82ml第三军陕人学硕士学位论文(4)5×TBE电泳缓冲贮存液Trisbase5

6、49硼酸27．59EDTA3．72249定容至1000ml，使用前稀释为1×(5)10×FAGelBuffer：(配置500ml10，(FAGelBuffe)成分所需量终浓度MOPS[3一(N一吗啡啉)乙磺酸]20．99200raM乙酸钠3．4950mM0．5MEDTA—Na210ml10raM用NaOH调PH至7．0后，DEPC．treatedwater定容至500ml(6)5×RNALoadingBuffer0．4％溴酚蓝溶液16I_tl500raMEDTA(PH8．0)801fl37％(12．3M)甲醛720p．1100％glyc

7、erol2mlformamide3084D110×FAGelBuffer4mlRnase．freewater定容至10ml，4"C储存(≤3个月)(7)l×FAGelRuningBuffer10×FAGelBuffer100ml37％(12．3m)甲醛20mlRnase—freewater定容至1000ml，每次取300ml(8)RPMI1640培养液RPMI1640干粉l袋NaHC0329青霉素100u／ml链霉素100U／ml去离子水定容至1000ml，过滤备用(9)RPMIl640完全培养基(DCs培养液)RPMI1640430m

8、l9第三军医大学硕士学位论文FCS青霉素L谷胱苷肽B．巯基乙醇非必需氨基酸丁酸钠(10)0．25％胰蛋白酶50ml5ml5mlO．5mi5ml5ml胰蛋白酶19EDTA0．0891xPBS定容至400ml，