降纤酶制备工艺与质量标准的研究

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1、摘要以中国长白山白眉蝮蛇蛇毒为原料，根据蛇毒的生物学特征，采用不同方法对蛇毒的真伪进行鉴别，并对降纤酶分离纯化的生产工艺以及质量标准进行了研究。采用三种不同介质sourse15Q，sourse15S，sourse30S进行离子交换色谱分离，能有效除去杂蛋白，保留活性组分。其中Sourse30具有低压系统分辨率很高、成本低的特点。用Heparin—sepharoseCL-4B，Heparin—sepharosecL一6B，Hepari’n—sepharose6。FastFlow三种亲和介质分离，得到的色谱图谱基

2、本一致。为一个峰，对降纤酶的分离能力无差别，考虑到生产中的成本，选用价格比较低的Heparin—SepharoseCL-6B。将得到降纤酶粗品，采用Sourse15PHE，Sourse15ETIt，Sourse15IS0三种介质进行疏水分离，各得到两个峰。活性检测表明，第二个峰为活性峰，Sourse15PHE活性组分的活性比另外两种介质得到的活性组分高。在此基础上采用凝胶介质Superdex200，Superdex30，Superdex75分离，得到分离峰相似，都是一个具有活性的洗脱峰。其dPSuperdex

3、75具有低非特异性吸附，提高回收率，分辨率、选择性高。经过介质筛选和工艺参数的小试研究，对工艺生产进行放大。最终经过离子交换，亲和色谱，经过滤除菌，巯水色谱分离，再超滤，凝胶色谱分离。得到的活性峰，经高效液相色谱分析，其纯度达99．096以上，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条单成份带，分子量为36500。该分离纯化方法经过实际生产应用，具有工艺过程简单，在生产过程中除去了神经毒、出血毒及其它有害毒素，与国内同类产品比较，具有降纤酶纯度高，副作用小，产品质量稳定等优点。参照2000年中国药典，对降纤酶理化性

4、质进行分析与检测，并进行稳定性考察。经观察和检测，在36个月内稳定，本品的有效期定为2年。为此，建立本产品的质量控制指标。与目前临床使用的t-PA，尿激酶，链激酶等溶栓制剂相比，蛇毒纤溶酶有其优点，可望成为临床联合应用溶栓制剂或作为替代溶栓药物。关键词：长白山白眉蝮蛇毒；降纤酶：制备工艺；分离纯化；质量标准AbstactAccordingtOitsbiologlcalcharacter,snakevenomofAgkistrodonhalyswasidentifiedbydifferentmethods．In

5、thispaper,theseparationandpurificationprocessandqualitystandardofdifibrasfromsnakevenomofAgkistrodonhalyswerestudied．Thesnakevenomwasseparatedthrou曲ionexchangemediasourse15Q，sourse15Sandsourse30S．TheactiveeluteWasretainedandmostotherproteinswereremoved．Thes

6、ourse30Swascheaperandhigherresolutioninlow—pressuresystem．Theelutefrom【ionexchangewassubjectedtOaffinitychromatograph)'withmediaHeparin—sepharoseCL-4B．Heparin—sepharoseCL一6BandHeparin—sepharose6FastFlow,】reapetively．耵lethreeaffinitymapswerealmostthesame，Hep

7、arin—SepharoseCL一6Bwaschosedascosteffective．Theactiveelutewascollectedascrudedifibrase，andseparatedbyhydrophobicchromatographyusingthreedifferentmediaSourse15PHE，Sourse15ETHandSourse15ISO．A11ofthethreehydrophobicmapsshowedtwopeaks，andthesecondpeakhadtheacti

8、vity．Sourse15PHEresultedinthedifibraseactivitvhigherthantheothertwomedia．TheactiveeluteWasseparatedbySuperdex200．Superdex30andSuperdex75asgelchromatographymedia．respectively．Eachofgelchromatographygave