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1、国家药品监督管理局国家药品标准WS1-XG-031-2000___________________________________________________________________________________________降纤酶Jiangxianme Defibrase 本品系长白山白眉蝮蛇[Agkistrodonhalys(ussriensisEmelianor)]或尖吻蝮蛇[Agkistrodonacutus(Guenther
2、)]蛇毒中提取的蛋白水解酶,每1mg蛋白含降纤酶效价不得少于1200单位。 【性状】本品为白色非结晶状粉末,有引湿性。 本品易溶于水。 【鉴别】(1)取本品,加水制成每1ml中含1mg的溶液,作为供试品溶液。取人-枸橼酸血浆[取枸橼酸钠38g,加水1000ml溶解,按枸橼酸钠溶液-人血(1:9)比例混合,3000转/min离心30分钟。取上清液分装成每支1ml,冷冻干燥,使用前加水1ml,摇匀,三小时内使用]0.3ml,加400IU/ml肝素钠溶液0.05ml,混匀,加入供试品溶液0.05ml,37℃保温,1分钟内,血浆应凝固,加入1%氯醋酸溶液
3、1ml,振荡,凝块全部溶解,呈澄清透明溶液。(2)取上述供试品溶液0.2ml,加L-BAPA液[取盐酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺(Benzoyl-L-Argi-nyl-P-NitroanilineHydrochloride)5mg,加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.2)(取三羟基甲基氨基甲烷18.17g与氯化钠0.8g,加水800ml溶解,用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.2,加水至1000ml)5ml,溶解]0.2ml,置37℃保温30分钟,溶液呈黄色。 (3)取本品适量,照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(附一)测定,其主成分分子量应为36000(±5000)。
4、 【检查】纯度 (1)取本品适量(约相当于蛋白量10μg),照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(附一),在分子量31000~41000以外不得出现其他电泳带。 (2)照高效液相色谱法测定(中国药典2000年版二部附录ⅤD)。 色谱条件与系统适用性试验 用凝胶色谱柱(如BiosepS20007.8mm×300mm,5μm);以0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)(取磷酸氢二钠175.4g与磷酸二氢钠79.56g,溶解于900ml水中,调节pH值至6.8,加水至5000ml)为流动相;流速为每分钟1ml;检测波长为280nm。理论板数
5、按降纤酶峰计算应不得低于3000。 测定法 取本品用流动相稀释成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液,取供试品溶液20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,按面积归一化法计算,供试品中主峰相对百分含量不得低于90.0%。 出血毒 取本品,用氯化钠注射液制成每1ml中含100单位的溶液作为供试品溶液。取体重18~22g的小白鼠5只,背部皮下注射供试品溶液0.2ml,注射后24小时处死动物,剥皮观察,小鼠背部注射部位不得有出血现象。神经毒 取本品,用氯化钠注射液制成每1ml中含75单位的溶液作为供试品溶液。取体重为300~500g的鸽3只,每1kg体重静脉注射
6、供试品溶液0.5ml,观察24小时,动物不得出现抽搐、死亡,如3只鸽中有一只出现抽搐或死亡,应另取鸽5只复试,均不得出现死亡。___________________________________________________________________________________________国家药品监督管理局发布国家药典委员会审定16-88 【效价测定】酶活力 以每1mg蛋白含酶活力计。 标准品溶液的制备 取降纤酶标准品,加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)制成每1ml中含20、10、5、2.5单位的溶液。 供试品溶液的制备 取本
7、品适量,用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)(取三羟甲基氨基甲烷2.42g与氯化钠0.585g,加水适量使溶解,用1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4,加水稀释至500ml)制成标准曲线范围内浓度的溶液。 测定法 取试管(1cm×10cm)4支,各精密加入0.4%纤维蛋白原溶液[取纤维蛋白原,用上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)制成0.4%可凝蛋白溶液]0.2ml,置(37±0.5)℃水浴中
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