扁吻鱼微卫星分子标记筛选、群体分析及东北雅罗鱼肾组织盐碱差异表达候选基因筛选

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3、ticepsDay）的微卫星分子标记。采用限制性内切酶Sau3AI对扁吻鱼基因组DNA进行酶切，选取250～750bp的片段进行PCR全基因组扩增，并利用生物素标记的（CA）8探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段连接T载体后转入DH5α大肠杆菌中，采用菌落PCR法筛选阳性克隆，最后挑取扩增片段大小在250～750bp之间的192个克隆菌落送生物公司测序。测序结果显示，含微卫星序列的克隆有53个。经统计，在这53个微卫星位点中完美型共36个,占67.92%;非完美型12个,占22.64%;混合型5个

4、,占9.43%。选取侧翼序列符合引物设计条件的微卫星序列50个，结果成功设计微卫星引物25对。引物筛选发现，24对引物可扩增出清晰条带，其中13对引物具有多态性。结果显示等位基因数在2～6，多态信息含量为0.2237～0.7445，PIC平均值为0.5353，12个(92%)位点表现出高度的多态性(PIC>0.5)，1个(8%)位点表现出中度多态(0.25＜PIC＜0.5)。观测杂合度（Ho)和期望杂合度（He)的平均值分别为0.5567和0.6893。同时随机抽取1000对鲤鱼引物检测扁吻鱼同源位

5、点的多态性，获得具多态性位点18对。采用微卫星分子标记的方法，利用31个微卫星分子标记对扁吻鱼及塔里木裂腹鱼的野生群体进行遗传多样性分析，以期对其种质资源进行有目的保护，为遗传育种等提供理论依据。共检测了扁吻鱼1个野生群体，24个个体，塔里木裂腹鱼1个野生群体，19个个体，2个群体的平均等位基因数A为7.78～11.65，平均有效等位基因数为Ne为4.91～6.81，平均观察杂合度Ho为0.6043～0.7077，平均期望杂合度He为0.7618～0.8313，平均多态信息含量PIC为0.7174～

6、0.7970。实验结果显示，扁吻鱼与尖嘴臀鳞鱼群体之间遗传相似系数I=0.6211（遗传距离DS=0.4763），平均遗传分化系数为0.1564，表明2个群体间存在明显的遗传分化，与分类学研究一致，属于同科不同属的种群。为从基因表达水平上研究鱼类耐盐碱机制，选取东北地区具有耐盐碱性状的东北雅罗鱼(LeuciscuswaleckiiDybowski)为实验材料，采用相对实时荧光定量I上海海洋大学硕士学位论文PCR法进行基因表达量差异检测。鉴于在碱度发生变化的过程中，鳃、肾是参与渗透压调节的重要组织，其

7、中的基因表达变化通常是最快、最灵敏的。通过查阅文献，根据梁利群等对雅罗鱼与斑马鱼芯片比对的结果，查阅动、植物耐盐碱相关的文献，挑选了11个与离子转运相关的膜通道蛋白基因，共设计引物17对。根据荧光定量RT-PCR的扩增特点和要求，所设计引物的扩增片段大小应在100～200bp之间。内参基因的引物序列参照李勇等报道的18SrRNA序列。随机分成两组，淡水对照组和盐碱待测组，每组19尾，两组鱼同时处理30d；30d内淡水对照组盐碱度维持不变，待测组25d内盐碱度升至40，维持5d。30d后同时采样，采集

8、雅罗鱼鳃、肾组织提取RNA并反转录成cDNA。随机挑选2个模板用普通PCR法对17对引物进行筛选，结果有2个候选基因及内参基因的引物扩增条带清晰、唯一。采用相对定量方法，使用AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem检测对照组和待测组各基因的实时表达量。用2-△△Ct法对结果进行分析，以18SrRNA为内参基因，结果发现，达里湖雅罗鱼的鳃组织中，盐碱组的V-ATPASE表达量比对照组高出1.97倍，clica表达量比对照组高出2.2