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1、硕士学位论文内封1：浙江海洋学院硕士学位论文基于转录组数据的鮸鱼分子标记筛选及基因差异表达分析作者姓名：车荣波指导教师：徐田军学位类别：理学硕士学科专业：海洋生物学学位授予单位：浙江海洋学院论文答辩日期：2015年6月10日硕士学位论文内封2：ADissertationforMaster’sDegreeSubmittedtoZhejiangOceanUniversityDevelopmentofmoleculemarkersandgenedifferentialexpressionanalysisofMiichthysmiiu
2、ybasedontranscriptomesequencingdataCandidate：CheRongboSupervisor：XuTianjunSpeciality：MarineBiologyDateOfSubmission：April2015摘要摘要鮸鱼，属于石首鱼科，是渔业和水产养殖业中一种重要的海洋经济鱼类。目前由于病原菌和寄生虫引起的疾病使鮸鱼的大规模养殖受到限制，大大降低了鮸鱼的产量和经济价值。鮸鱼转录组和基因组信息的缺乏限制了研究人员对鮸鱼的发病机制和免疫系统的研究。本文中，我们首先构建了健康鮸鱼的肝脏、脾脏和
3、肾脏的cDNA文库并使用Illumina公司双末端测序方法测序，用于鮸鱼功能基因的发掘和分子标记的开发。为了了解鮸鱼感染哈维氏弧菌后的免疫机制和获得大量高表达的免疫基因，我们分别对健康的鮸鱼脾脏(Ctrl)和感染哈维氏弧菌的鮸鱼脾脏(Vha)进行了转录组测序。在本研究中，通过两次鮸鱼转录组测序分析，我们获得的主要结论如下：1.我们利用IlluminaHiSeq2000高通量技术平台对鮸鱼肝脏、脾脏和肾脏进行转录组测序。通过筛选掉低质量的rawreads我们共获得了25,760,602条cleanreads，组装得到69,071
4、条unigenes。采用BLAST相似性比对方法把这些序列比对NT,NR,Swiss-Prot和KEGG数据库，共有45,676条unigenes得到了注释。有8,423个unigenes获得了GO注释并分类到51个功能类别中，有21,662个unigenes被归纳到COG的25个功能分类，共有23,927条获得了KEGG注释，共参与123条代谢通路中。根据这些注释，我们筛选得到了498个免疫相关基因，并根据功能分成了14类。2.经过筛选，我们在11,251条unigenes中共获得了14,885条SSR位点，其中双碱基重复类
5、型最多。从设计的87对引物中共筛选出58对微卫星引物，其中25条为多态性微卫星标记。这些位点的等位基因数为2-9，平均等位基因数为3.88。观测杂合度(Ho)为0.100-1.00，平均值为0.433；期望杂合度(He)为0.095-0.784，平均值为0.489。PIC值为0.005-0.991，平均PIC值为0.49。另外，我们还检索到了8,510个预测的单核苷酸多态性位点，其中包括6,182个转换和2,328个颠换。3.通过对鮸鱼感染哈维氏弧菌前后脾脏的转录组测序，我们分别获得50,339,252条reads和50,66
6、1,542条reads。通过与基因组比对筛选后，共得到37,410,818条cleanreads，组装得到78,176条unigenes，并进行了生物信息学分析。4.通过对这两组样本进行表达定量分析，共有41,845个基因在Ctrl样品中表达，有41,989个基因在Vha样品中表达。共获得1,350个显著性差异表达的基因，其中上调的有782个，下调的有568个，并进行了差异表达基因的GO功能富集分析和I基于转录组数据的鮸鱼分子标记筛选及基因差异表达分析KEGG信号通路富集分析。5.依据差异表达基因的GO富集分析和KEGG信号通
7、路富集分析，筛选获得大量的免疫相关基因及其在哈维氏弧菌感染后的调控机制。如免疫球蛋白IgM、IgD和IgA，趋化因子及受体CCL19、CCL21、CCL25、CXCR3和CXCR7，以及补体C1Q、C3、C6和C7等。本文是第一次对鮸鱼转录组的研究，该数据为获得那些参与因病原菌和疾病引起免疫反应的新基因提供了大量的资源，基因差异表达分析将有助于我们理解鮸鱼抗细菌的免疫反应机制。此外，在本研究中开发的成千上万的潜在SSR和SNP标记对将来鮸鱼分子标记辅助育种来说将是重要的资源。关键词：鮸鱼；转录组；免疫基因；分子标记；差异表达基
8、因IIABSTRACTABSTRACTThemiiuycroaker(Miichthysmiiuy)whichbelongstofamilySciaenidae,isanimportantspeciesofmarinefishthatsupportscapturefisher
