山羊痘荧光抗体检测和pcr方法的建立

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1、贵州大学2008届硕士研究生学位论文山羊痘荧光抗体检测与PCR方法的建立摘要山羊痘(Goatpox，GP)是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GPV)引起的一种高度接触性传染病。临床上以体温升高，全身皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为主要特征。本病在印度、孟加拉、中东以及非洲中北部地区呈地方性流行，对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。本病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国也将其列为国家一类动物疫病。近年来，我国黑龙江、四川和云南等省份相继报道了山羊痘的发生与流行。2002年lO月，本病在贵州省首次爆发

2、，并波及了8个养羊较为集中的地区，发病率高达66．38％(2940／4429)，死亡率为42．06％(1863／4429)；2007年8月，贵州省某地区又一次爆发该病。为对山羊痘疑似病例作出确定性诊断，本研究开展了山羊痘血清学与分子生物学检测方法的研究，取得了以下研究成果：1．山羊痘荧光抗体试验的建立：采用饱和硫酸铵盐析法和SephadexG．25层析法从兔抗GPV高免血清中提纯IgG，标记荧光素，制备了山羊痘直接荧光抗体，用于检测感染细胞中的GPV抗原。结果表明，该方法能检测出BHK-21感染细胞中的病毒抗原，荧光抗体的最适工作浓度确定为1：32，且这种荧光能够被

3、山羊痘标准阳性血清特异性抑制。用制备的荧光抗体分别检测感染GPV标准弱毒株、疫苗株及贵州分离株的BHK-21细胞抹片和飞片，结果均为阳性，而正常细胞对照均为阴性。2．基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析：参照GenBank已发表的GPV基因序列，针对P32基因设计与合成了1对特异性引物，成功地建立了针对P32基因的PCR方法。PCR产物的酶切结果证实该PCR方法具有较好的特异性；敏感性检测显示，其DNA模板最小检出量为19．06x103Pg；利用该方法对贵州省临床痘疹样本进行现场检测，其阳性检出率为100％(10／10)。采用GelExtractKit试剂

4、盒回收纯化P32基因，与pMDl8．T克隆载体4"C连接过夜，转化至感受态细胞DH5a，经PCR和酶切鉴定后送往大连宝生物工程有限公司进行序列测定，结果表明上述4株毒株的P32基因序列与国内外羊痘毒株之间核苷酸的同源性为97．9％"100％，所推导氨基酸的同源性为96．2％--一100％。山羊痘荧光抗体检测与PCR方法的建立3．基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析：针对GPVITR基因设计与合成了1对特异性引物，成功地建立了针对ITR基因片段的PCR方法。经PCR产物的酶切分析证实，该PCR方法亦具有较高的特异性；敏感性检测显示，其DNA模板最小检出量

5、为24．40pg；用该方法对贵州省临床痘疹样本进行现场检测，其阳性检出率亦均为100％(10／10)。回收ITR基因片段，与pMDl8一T载体连接，转化至DH5a，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定，结果表明上述4株毒株的ITR基因片段序列与国内外羊痘毒株之间核苷酸的同源性为98．2％"100％，所推导氨基酸的同源性为96．5％"100％。4．通过PCR的特异性与敏感性检测以及基因序列的同源性比较分析，结果表明，基于ITR基因建立的PCR方法在敏感性及其基因序列保守性上均优于针对P32基因建立的PCR方法，这为临床上山羊痘的确诊建立了一种快速、简单、特异、敏感的PCR

6、方法。关键词：山羊痘；荧光抗体；PCR方法；建立；序列分析2贵州大学2008届硕士研究生学位论文ThedetectionoffluorescentantibodyandestablishmentofPCRmethodforgoatpoxAbstractGoatpoxisahighlycontagiousdiseaseofgoatsandsheepcharacterizedbypyrexia,generalizedskinandinternalpoxlesions，andlymphadenopathy．Thediseaseiscausedbygoatpoxvirus(

7、GPV)，whichisenveloped，double-strandedDNAvirus，classifiedinthegenuscapripoxvirusofthefamilypoxviridae．GoatpoxisancientdiseasethatiscurrentlyendimicintheMiddleEast,theIndiansubcontinent,Bangladesh,andCentralandNorthernAfrica,ThedeseaseisdefinedasaheavydiseaseofanimalbyOIE，basedonfurthe