脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖和分化影响

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1、脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖和分化的影响中文摘要神经外科硕士研究生：梁朝峰导师：郭英副主任医师摘要研究背景和目的神经于细胞(neuralsLemcells，NSCs)是指分布于神经系统具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细腿的一类细胞。它具有以下特性：(1)体外在丝裂原信号刺激F可大量增殖；(2)在体外去除丝裂原信号后即分化为神经系终末细胞，因而失去增殖潜能而不具有致瘤性；(3)能与宿主细胞发生神经整合，有利于功能重建。神经干细胞诱导分化的研究是目前研究的热点。神经干细胞群体的增殖、分化和存活依赖一些信号分子的相互协调作用，这些信号分子包括

2、白介素、FGF一2、EGg、TGF、LIF、BDNF、GDNF等，但是目前的研究显示，即使使用最好的神经营养因子，最多只能使一半以内的干细胞分化为神经元。这可能是由于NSCs增殖、向不同终末神经细胞方向分化需要特定的局部微环境的支持。这种微环境包括NSCs以外的细胞和细胞外基质、微血管成分及其相关的一系列信号分子。微环境各因素的整体化、系统化相互协调和配合，在时间和空间顺序上调控神经千细胞的增殖和分化。新近研究发现，血管内皮细胞不仅具有重要的屏障保护和半透膜的营养输送作用，同时还具有极其重要的代谢控制和内分泌调节作用，迄今为止，已发现血管内皮细胞能合成和释放几十种生物活性物质，这些信号分子在组

3、织、细胞的生长、发育中起到极为重要的作用，如研究发现，血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体FLK一1、转化生长因子一B(TGF—B)、碱性成纤维生长因子(BFGF)等活性分子，激活一些分化转录因子女NNeuroD和Pax6、Pdxl，最终指导胚胎组织的细胞迁移、分化和生长，使得胚胎组织逐步成为结构复杂的成熟器官。研究发现，干细胞的增殖和分化是由包括微血管在内的局部微环境调控的，脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖和分化的影响中文摘要而在中枢神经系统胚胎发育过程中，脑室壁周围细胞能产生血管内皮细胞生长因子刺激局部血管的生长，在成熟的脑组织的海马、室管膜下区等富含神经于细胞的区域，神经干细胞分布与

4、微血管的位置关系极为密切。这些研究提示，无论是发育中或是成熟的中枢神经，神经干细胞与脑微血管内皮细胞(Brainmicrovascularendothelialce儿s，BMECs)存在着密切关系。目前，BMECs是否能够调控神经于细胞的增殖、分化，迄今为止，国内尚未见有相关研究的报道，国外报道也极为罕见。基于此，本课题拟自新生大鼠脑组织分别分离、培养NSCs和BMECs，然后，建立起两者的共培养模型，探讨脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖、分化的影响，为NSCs应用于脑损伤修复与再生的研究奠定基础。方法1．NSCs的分离培养和鉴定从新生大鼠分离海马组织和室管膜下区(subventricular

5、zone，SVZ)的神经干细胞，并建立NSCs的体外培养体系，观察NSCs的生长特性，免疫荧光法检测NSCs的标志物神经巢蛋白(Neuroepithelialstemcellprotein，nestin)；诱导分化后，检钡g神经元细胞的标志物神经丝蛋白(Neurefilament，NF)和星形胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白(GIialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。2．BMECs的分离培养和鉴定从新生大鼠大脑皮层，通过二次酶消化和二次梯度离心方法分离脑微血管内皮细胞，观察BMECs的生长特性，以VIii因子相关抗原进行免疫组化检测。3．BMECs对NSCs与增殖和

6、分化的影响实验分组：空白对照组：含1％FBS(胎牛血清>和2％B27的DMEM／F12培养NSCs共培养组：利用transwell建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型，加入对照组培养液培养细胞；ECGF组：在对照组培养液加入ECGF(endothelialcellgrowthfactor，血管内皮细胞生长因子)培养细胞。在第7天通过相差显微镜形态学观察各组细胞形态并进行nestin和NF免疫荧光染色并计算各阳性细胞比例；然后共培养组去除BMECs和ECGF组去除ECGF，各组均改用含1％FBS的DMEM／F12培养，通过相差显微镜形态学观察各组细胞形态并进行NF免疫荧光染色计数，计算各组

7、阳性细胞率。各组结果分别进行单因素方差分脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖和分化的影响中文摘要析和SNK—q法进行组问两两比较的显著性检验(q=O．05)。结果1．第一部分：分离的细胞呈细胞克隆球悬浮态生长，免疫荧光检i贝1]nestin阳性，诱导分化后，NF和GFAP均阳性，证实分离的细胞为神经干细胞，诱导分化后的细胞为神经元细胞和星形胶质细胞。2．第二部分：分离的细胞呈典型的鹅卵石形，区域性单层