阿维菌素高产菌株选育和透明颤菌血红蛋白基因克隆表达的研究

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1、关于学位论文独立完成和内容创新的声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谓十的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：夺住玷签字日期：如口i年占月形日学位论文版权使用授权书论文《阿维菌素高产菌株的选育和透明颤菌血红蛋白基因的克隆表达研究》系剑垫兰捏学院微生物墨生丝垫堂专业奎佳瑾(作者姓名)在沈阳药科大学攻读博士口／硕士囱学位而完成的作

2、品。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳药科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于l、保密口，在口三年／口五／年解密后适用本授权书。2、不保密回。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：导师签名：享斜j氧积日期：删年日期：阳D6年‘月坩Et‘月膨日沈m药科人学倾j卜学位论义摘要摘要阿维链霉菌是阿维菌素的产生菌，由于其发酵液较粘稠而导致溶氧较差，因此溶氧成

3、为阿维菌素产量提高的限制因素之一。本研究旨在通过在阿维链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因(增6)来改善氧的传递，进而改善菌体生长，提高阿维菌素的产量。对阿维链霉菌原生质体的制备和再生条件进行优化。首先考察了影nsaJN维链霉菌原生质体形成的因素，发现在R2YE、YMB、SM、YEME儿种链霉菌常用的液体培养基中，通过R2YE培养基收获的菌体形成原生质体的效率最高。菌丝培养采用二级培养，即用R2YE培养基28。C培养48h，转种到补加O．25％甘氨酸的R2YE培养基中，28。C继续培养20～24h，溶菌酶作用浓度为2rag·mL一，309C酶解30rain，在

4、此条件下，原生质体的制备量为63xi08个·mL～，原生质体的再生率最高，达到1．98％。应用双亲灭活原生质体融合技术选育阿维菌素高产菌株，得到了一株高产菌株StreptomycesavermitilisF32，阿维菌素总发酵单位达390499·mL～，其中Bl。组分产量较高，达101699·mL～，较出发菌株产抗单位提高了117．1％。利用链霉菌质粒p1J702和带啦的大肠埃希菌质粒pUCl9-唧，构建大肠埃希菌一链霉菌穿梭质粒pSY702。将该质粒以PEG一介导的方式转入阿维链霉菌原生质体中，利用硫链丝菌素抗性筛选转化子。CO结合差光谱法检测在420r

5、im处有吸收峰，表明血红蛋白己在阿维链霉菌中表达且具有生物活性。通过高效液相色谱(HPLC)对转化子摇瓶发酵产物进行分析表明，转化子仍然合成阿维菌素，而且转化子在供养不足时生产阿维菌素的能力比对照更强。说明含vgb的转化子比不含vgb的对照菌更能耐受贫氧环境，合成阿维菌素效率更高，在贫氧环境中表现出其优越性。以筛选到的转化子savermitilisT26为实验菌株，对发酵条件进行优化。结果表明随着发酵时间的延长，阿维菌素产量不断提高，发酵lOd阿维菌素的产量最高；选用18h的种龄、15％的转种量可使阿维菌素的产量提高。通过均匀设计优化发酵培养基配方，发酵培

6、养基(％)为：玉米淀粉8．0，黄豆饼粉O．7，花生饼粉1．1，酵母粉0．875，酵母膏0-2，玉米浆O．35时，使得SavermitilisT26的发酵效价提高了38％，Bi。发酵单位达到120699．mL_l。关键词：阿维菌素；原生质体融合；原生质体转化：透明颤菌血红蛋白：发酵：溶氧沈m药科人学他卜学位论立ABSTRACTStreptomycesavermitilisisakindofmicrobethatcarlproduceavermectin．ItsfermentationbrothisSOmucousthatitcannotdissolvetoo

7、muchoxygen，SoDO(dissolvedoxygen)becomesoneoftherestrictedfactoraffectingtheincreaseofavermeclinyield，ThisstudywascarriedouttOimprovethegeneticallyengineeredbacteria’SabilitytOtransportandabsorboxygen，betteritsgrowth，aswellasstrengthenitssynthesisofproteinandsecondarymetabolites，by

8、expressionofVitreoscillahemoglobi