功能性稳定表达cre重组酶的verocre细胞系的构建

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1、郑州人学2009届硕1学位论文中文摘要功能性稳定表达Cre重组酶的vero一Cre细胞系的构建硕士研究生吴少璞导师索爱琴教授许予明教授郑州大学第一附属医院神经内科河南省人民医院神经内科郑州450052任石摘3七CTe一LoxP位点特异性重组系统属于定位重组系统之一，是目前国内外研究和应用比较广泛的一种位点特异性重组系统。Cre一LoxP系统是源于Pl噬菌体的一个DNA重组体系，由Cre重组酶和相应的LoxP位点组成，它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点)，该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定D

2、NA片段删除。其应用主要包括基因失活或敲除、基因激活、基因顿换、基因易位，还可以利用此系统进行载体的构建。目前，各类病毒载体为基因治疗提供了重要的研究工具，从病毒在神经元细胞建立潜在感染的能力来看，单纯疤疹病毒(HSV，herpessimplexvirus)特别适合于神经元产生基因，因此HSV广泛应用于神经内科疾病的基因治疗研究中。细菌人工染色体(BAC，baeterialartifieialchromosome)技术，即在BAC基础上的全长基因组感染性克隆技术的应用使HSV-1载体构建发展到新的阶段，该技术使HSV

3、-l基因组在BAC质粒内稳定表达，并能对其基因进行操作。BAC质粒克隆有LoxP位点，便于载体构建过程中Cre重组酶与其发生重组反应，从而将BAC主体片段删除，得到HSV载体;HSV扩增子构建中，LoxP位点之间携带有包装信号，Cre重组酶的作用能去除包装信号。通过以上途径，完善HSV载体以便进行神经内科疾病基因治疗研究。本实验通过构建Cre重组酶表达质粒，建立Cre重组酶表达阳性的vero一Cre细胞系。HSV-1载体感染该细胞后既能产生病毒，同时将LoxP位点之间的BAC片断删除;HSV-1扩增子载体构建过程中，

4、应用Cre一LoxP系统切除辅助病毒的郑州大学2009届硕卜学位论文中文摘要包装信号Pac产生扩增子病毒，达到了大幅减少辅助病毒的同时又增加扩增子病毒滴度的目的。目的:构建cre重组酶慢病毒表达质粒，建立cre重组酶表达阳性的vero一Cre细胞系，利用ere一Loxp重组反应为Hsv-1载体构建过程中BAc质粒的去除和扩增子构建过程中包装信号的切除提供实验材料。方法:1.通过限制性内切酶Neol和EeoRI双酶切获取载体e66一pGEM一下sv4o-cre中约Zkbp的cre重组酶片段，连接到经sall和EcoRI

5、酶切的慢病毒载体pLKO.l一puro一上，形成重组质粒pLKo.l一puro一ere;转化大肠杆菌(eseheriehiacoli，E.coli)nH5a感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，Mlul和EeoRI双酶切鉴定。2.将重组载体质粒pLKo.1一Puro一cre、包装质粒△8.2和包膜质粒vsv-G经转染试剂FuGENE6共转染293T细胞，产生稳定表达Cre重组酶的慢病毒颗粒。3.病毒颗粒感染vero细胞，采用嗓吟霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法，得到Cre重组酶表达阳性的vero一Cre细胞，

6、并挑取单个克隆形成阳性细胞系。4.通过PCR扩增vero一ere细胞DNA中的ere片段，BAC质粒转染至细胞系鉴定功能，且对GFP阳性细胞数目进行统计学分析。结果:1.双酶切得到cre重组酶片段，重组到慢病毒载体质粒PLKo.1一Puro中后，相应地筛选出阳性菌落。2重组慢病毒载体质粒PLKo.l一Puro一Cre经过酶切鉴定显示重组质粒构建成功。3三质粒共转染293T产生出慢病毒颗粒4筛选出嘿吟霉素对vero细胞的最小致死浓度为8林留铂1，重组慢病毒感染vero细胞，并筛选出Cre重组酶表达阳性的细胞克隆。5.p

7、CR扩增出560bp的片段，BAC质粒转染至vero和vero一ere细胞后，oFp阳性细胞数有显著性差异(p<0.01)。郑州大学2009届硕卜学位论文中文摘要结论:成功构建功能性稳定表达Cre重组酶的vero细胞系，为HS从1载体的构建及其应用奠定了基础。关键词:vero一Cre细胞系;Cre重组酶;HSV-1载体;慢病毒载体郑州人学20()9届硕1学位论文英文摘要ConstrllCtionofFunCtional、rcro一CreCellLineExPressingCreRecombinasePostgradu

8、ate:WuShaoPuTutors:SuoAiqiXuYumingDePartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHosPital，ZhengzhouUniversityDePartmentofNeurology，PeoPle，5hosPital，HenanProvineeZhengzhou，450052Abs