家蚕转胶蛋白基因的原核表达及功能的初步研究

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1、浙江理I：人学硕+学位论文摘要转胶蛋I刍(transgelin)作为一种肌动蛋白结合蛋白，在成体脊椎动物的平滑肌组织中含量丰富。转胶蛋白的表达是平滑肌细胞(smoothmusclecells，SMC)早期分化的标志。目前，国内外对转胶蛋白的研究多数集中在脊椎动物上，而对无脊椎动物的研究较少。本研究从NCBI核酸数据库中搜索到家蚕转胶蛋白(BmTGN)的cDNA序列。该基因ORF长为567bp，编码188个氨基酸残基，预测分子量为20．89kD。同源性比较表明该基因编码的氨基酸序列与蜜蜂同源性为86．7％。将BmTGN基因的ORF克隆到表达载体pET-28

2、a(+)_(N应的酶切位点上，得到重组质粒pET-28a(+)．BmTGN。将该重组子转化E．coliRosetta。经IPTG诱导表达后，裂解菌体作SDS．PAGE分析，与阴性对照相比在25kD左右的位置有一条特异性蛋白条带。以亲和层析的方法纯化上清液，获得目的蛋白His．BmTGN。目的蛋白经FPLC反相柱层析进一步纯化后，进行质谱分析，结果显示该融合蛋白的分子量为24．589kD，与理论值24．45kD相符，从而证实了该蛋白表达的正确性。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体，ELISA检测该抗体血清的效价可达1：6400以上。利用实时荧光定量

3、PCR的方法，对BmTGN在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA的量进行比较，并采用Westernblotting方法对BmTGN蛋白的表达进行分析。结果表明，该蛋白在蚕蛹中表达量最低，而在蛾中含量最高。在五龄幼虫的中肠、表皮、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、卵巢、气管、头部等9个组织中均有不同程度的表达，而在中肠中的表达量最高。通过亚细胞定位发现该蛋白主要存在于细胞质中。本研究为进一步探讨BmTGN基因在家蚕中的生物学功能打下了良好的基础。关键词：家蚕；转胶蛋白；组织定位；亚细胞定位浙江理1i人!学硕十学位论文AbstractTransgelinisau

4、biquitousproteinamongsmoothmuscletissuesofnormaladultvertebrates．Transgelinexpressionisoneofthefirstmarkersofsmoothmuscledifferentiationduringembryogenesis．Mostresearchesoftransgelinarefocusedonrathervertebratethaninvertebratetodate．WeobtainedacDNAsequenceoftransgelininBombyxmori

5、fromNCBIproteinlibraryandnamedBmTGN(Bombyxmoritransgelin)．Concurrentlybioinformaticmethodswereappliedtoanalyzetheobtainedsequenceanditsinducedaminoacidsequence，includingopenreadingframe(OR_V)，homologoussequencesandSOon．TheOR／：ofBmTGNgenewas567basepairsthatcouldencode188aminoacids

6、withapredictedmolecularweightof20．89kD．Additionally,thesequenceoftheaminoacidsencodedbythisgenewasmoreconservativeininvertebratesthroughthehomologycomparision．UsingpET-28a(+)astheexpressionvector,andconstructedtheprocaryoticexpressionplasmidpET-28a(+)-BmTGNwhichWasidentifiedbyPCI

7、Ldoubledigestionandsequencing．TherecombinantplasmidWastransformedintoE．coliRosetta．AfterinducingwithIPTG,theanalysisofSDS—PAGEshowedthattherecombinantproteinwasexpressedinabout25kDlocation．TherecombinantproteinWassolubleandWaspurifiedwithgelfiltrationchromatographyandmetal—chelat

8、ingaffinitychromatography．Themolecularwe