家蚕细胞周期蛋白家族基因表达特点及功能的分析

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1、家蚕细胞周期蛋白家族基因的表达特点及功能分析中文摘要细胞周期蛋白(Cyclin)是一种与细胞周期相关的核蛋白，从酵母到人类等真核生物中都具有广泛作用。Cyclins周期性积累与分解对细胞周期进程起关键作用。Cyclins通过依次激活相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclindependemkinase，CDK)，多层次有序调节细胞周期。Cyclins还决定CDK底物的磷酸化，驱动细胞通过细胞周期的各时相或检测点，推动细胞周期的进程。在细胞的增殖、分化及肿瘤发生中起重要作用。在家蚕(Bombyxmori)中共发现5种细胞周期蛋白，即C

2、yclinA、B、B3、L1、E。本研究以家蚕为研究对象，对家蚕细胞周期蛋白家族基因的表达特点及CyclinE基因的功能进行了分析，获得的主要结果如下：1、家蚕细胞周期蛋白家族基因的克隆及结构特征与表达分析利用家蚕基因组数据库信息设计引物，分析Cyclins在家蚕中的表达情况。分别克隆了5个基因，对基因序列结构的分析结果表明，CyclinA、B、B3基因分别有7个外显子，CyclinE基因有8个外显子，CyclinL1基因只有1个外显子。CyclinA及CyclinE基因存在较多的剪切方式，CyclinA基因主要包含大小为2141b

3、p和2173bp的2种转录本，其变化在第7个外显子，CyclinE基因则含有l422bp、1290bp及1194bp等6个大小不同的序列，变化集中于第5～7外显子，而CyclinB、B3、L1基因则相对稳定。对蛋白序列进行分析表明，这5种周期蛋白都具有典型的周期蛋白盒序列，CyclinA、B、B3、L1都有2个连续的周期蛋白盒，CyclinE只有1个周期蛋白盒。Cyclins家族基因的表达存在组织特异性，CyclinA基因只在精巢中表达，CyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达，CyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马

4、氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达，CyclinB和CyclinLl基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究细胞周期蛋白在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。2、家蚕CyclinE基因在5龄幼虫组织表达的剪切变体和表达特征l中文摘要家蚕细胞周期蛋白家族基冈的表达特点及功能分析为研究CyclinE基因在家蚕不同组织中的表达情况，克隆了家蚕CyclinE基因在5龄幼虫不同组织表达的cDNA序列，在不同组织中获得该基因的6种不同剪切变体，这6种剪切变体前4个外显子和最后一个外显子都相同，变化主要集中在

5、5～7外显子处。这些结果提示，不同组织中表达的CyclinE基因剪切体不同，可能与特殊的细胞周期类型或者特定的细胞周期阶段有关，多样而独特的CyclinE．CDK2复合物可能调节不同组织在特定发育中的细胞周期进程。同源性比较显示，不同物种来源的CyclinE周期蛋白盒具有较高的保守性，有35个氨基酸为共同保守序列。利用实时定量PCR分析显示，CyclinE基因在家蚕5龄第3天各组织中均有表达，并且在脂肪体中的表达相对较高。研究结果可为进一步探讨家蚕CyclinE基因在家蚕生长发育过程中的生物学功能提供参考。3、家蚕细胞周期蛋白家族基

6、因在5龄3天幼虫组织中的表达采用实时荧光定量PCR方法检测了家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄3天幼虫组织中的转录水平。结果显示，在丝腺中，CyclinE基因大量表达，CyclinA、L1基因表达较弱，而CyclinB、B3基因没有检测到表达。家蚕丝腺细胞属于核内有丝分裂细胞，在Gl期和S期之间不断转换，其间不经过G2期和M期的转换。此结果表明，CyclinE基因在丝腺细胞中GdS期起重要作用。而CyclinB、B3基因在G2／M期起作用。同时也检测了其他几种组织中CyclinA、B、B3、L1基因的转录水平。结果表明，CyclinA、

7、B、B3、L1基因都在精巢中高表达，推测这几个基因在家蚕精巢中的精母细胞发育形成精子进行分裂时起着重要作用。4、CyclinE基因干扰RNA对家蚕细胞增殖的影响为了研究siRNA抑制家蚕CyclinE基因表达后，对BmN细胞增殖及细胞周期的影响。化学合成针对CyclinE基因的干扰RNA小片段，通过脂质体转染家蚕BmN细胞，应用实时荧光定量PCR法测定siRNA干扰后CyclinEmRNA水平，流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期分布。结果表明，转染siRNA后，siRNA-1252(针对1252nt开始的mRNA序列)和siR

8、NA-568分别使BmN细胞CyclinEmRNA水平降低了68％和90％：流式细胞仪检测结果显示，Go／Gl期细胞比率增多，S期和GE／M期细胞比率减少。结果表明，在家蚕BmN细胞中导入siRNA有效地抑制CyclinE基因的转录，