家蚕bm040825基因的表达与其功能初步的研究

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1、浙江理工大学硕士学位论文家蚕Bm040825基因的表达及其功能初步研究摘要我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA，经NCBI比对分析后初步确定其为一未知基因，命名为家蚕Bm040825(Bombyxmori040825)，GenBank登陆号为DN236938。家蚕Bm040825基因cDNA长为869bp，开放阅读框大小为489bp，采用DNAStar软件进行预测发现该基因编码162个氨基酸残基，预测分子量大小为19．4kD，等电点为9．58。从GenBank等数据库中利用Blast检索，发现

2、与Bombyxmori同源性较高的均为一些假设或预测蛋白，这些蛋白功能未知。将家蚕Bm040825的cDNA序列与家蚕基因组序列比对，结果表明该基因由一个外显子组成。我们根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物，PCR扩增后经BamHI和XhoI双酶切，插入融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点，成功构建重组融合蛋白表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析，在23kD处有一浓集特异性蛋白条带，与预期值相符。重组蛋白以

3、可溶的形式表达，通过亲和层析纯化了重组蛋白，并使用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制各多克隆抗体，ELISA检测效价大于1：6400。以家蚕Bin5细胞进行免疫细胞化学实验，结果显示，在未分裂细胞中，Bm040825蛋白在细胞核与细胞质当中均有分布，而对于处在分裂期的细胞，Bm040825蛋白主要分布在细胞质中，在细胞核内几乎不存在。构建绿色荧光重组表达质粒pEGFP-N1-Bm040825转染家蚕Bm5细胞做亚细胞定位，在转染后36h，我们只在细胞核当中检测到绿色荧光信号，而转染后48h，在细胞核和胞质中均发现融合绿色荧光的

4、分布。提取家蚕五龄幼虫各组织的总蛋白，进行免疫印迹实验，结果显示，Bm040825蛋白在家蚕的中肠组织中有表达，但在丝腺等其他组织中没有检测到该蛋白的存在，我们认为该蛋白属家蚕中肠特异性蛋白。这些结果为深入研究Bm040825蛋白奠定了基础。关键词家蚕；Bm040825基因；亚细胞定位；免疫细胞化学；蛹Ⅱ浙江理工大学硕士学位论文StudyontheexpressionandfunctionalanalysisofBm040825genefromsilkwormpupa(Bombyx肌D功AbstractAccording

5、tothelarge—scaleeDNAsequencingofsilkwormpupae，auniqueunknownBombyxmorieDNAwasidentifiedafterBlastbasedonNCBIdatabase．WepreliminarynominatethisnovelgeneasBm040825(BombyxmoriBm04082S)，andGenBankaccessionnumberisDN236935．Thelengthofthegeneis869bp．ItcontainsallORFof4

6、89bp，anditencodes162aminoacids、)l，itllthepredictedmolecularweightof19．4kDandisoelectriepointof9．58．AftertheBlastbasedonNCBIdatabase，wefoundthepredictedaminoacidsequencesofBm040825shareshighlyhomologoustothehypotheticalproteinandunknownprotein,andnleirfunctionsare

7、unknown．WealsotakegenomealignmentbetweenBm040825eDNAandsilkwormgenome，andtheresultsshowthatthisgeneincludesonlyoneexon．AccordingtotheORFofBm040825，twoprimersWeredesignedtoobtainthecodiIlgregionofBm040825genefromsilkwormpupaeESTdatabase．TheORFofthegeneWasclonedint

8、opET-28a(+)vector、jl，itllBamHIandXhoIdigest．TherecombinantplasmidWastransformedintoE．coliBL21(DE3)．PCRanddigestionwithBamHI／XhoIshowedthatthedesignedfragmentWa