家蚕ras+oncogene(bras2)的表达、纯化以及特性分析

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1、浙江理工大学硕士学位论文摘要Ras超家族是一类重要的功能蛋白，可介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的信息通路，对细胞生长、分化、存活、增殖等多种功能的调节发挥重要作用。通过NCBI数据库分析，发现家蚕中有Ras超家族的成员rasoncogene(Bras2)基因，并将其命名为BmBras2。BmBras2基因的cDNA序列全长为1,412bp，开放阅读框(ORF)为603bp，编码200个氨基酸残基，预测该蛋白的分子量为22．9kD，等电点(pI)为6．62。BmBras2基因的Genebank登陆号为AB206960。通过PCR的方法扩增BmBras2

2、基因的ORF并插入到载体pET．28a(+)的EcoRI和HindIII位点，构建重组表达质粒pET．28a(+)-BmBras2，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。筛选阳性克隆后，经IPTG诱导，带有His标签的重组蛋白rBmBras2得以成功表达。表达的rBmBras2蛋白经过镍柱亲和纯化后，以纯化的重组蛋白为抗原，免疫雄性新西兰大白兔获得该蛋白的多克隆抗体。经ELISA检测，抗体效价可达1：12，800以上，Westernblot检测抗体的特异性良好，说明该多克隆抗体符合进一步实验的要求。我们对BmBras2基因在蛋白表达和基因转录两个水平进行了表

3、达分析，Westernblot和荧光定量PCR的结果说明BmBras2在四个发育时期都有表达，在蛹中的表达量最高，在五龄幼虫、蛾和卵中的表达量相对较低；在家蚕的八个组织中也都有表达，在头、肠和表皮中的表达量相对较高。用免疫荧光技术对目的蛋白进行亚细胞定位，发现BmBras2蛋白主要定位在Bm5(家蚕卵巢上皮细胞)的细胞核中，部分定位于细胞质中而不存在于膜上。相关的细胞增殖实验，显示rBmBras2能促进肝癌细胞PLC及HepG2的增殖而不能促进正常肝细胞L02的增殖。该结果为进一步研究BmBras2蛋白的相关功能奠定了一定的基础。关键词：家蚕；BmBras2

4、；表达分析；亚细胞定位；细胞增殖浙江理T火学硕士学位论文AbstractTherassuperfamilyisanimportantkindoffunctionalproteins．Theyplayessentialrolesinavarietyofcellularresponsesincludingcellgrowth，differentiation，survivalandproliferation．Wefoundamemberofrassuperfamilynamedrasoncogene(Bras2)frombombyxmorithroughanaly

5、zingtheNCBIdatabaseandwecalledrasoncogene(Bras2)asBmBras2．ThecDNAofBmBras2fromBombyxmoriconsistsof1,412bp．Theopenreadingframe(ORF)contains603bp，encoding200aminoacidresidueswitllapredictedmolecularweightof22．9kDandtheoreticalisoelectficpointOptlof6．62．ItsaccessionnumberinGenBankisAB

6、206960．TheORFofBmBras2wasclonedbyPCRandtheninsertedintothesitesofEcoRIandHindIIIofpET-28“+)．Arecombinantexpressionplasmid，pET-28“+)一BmBras2，wasconstructedandtransformedintoE．coliRosseta(DE3)．RecombinantHis-tagBmBras2(rBmBras2)wasexpressedsuccessfullyinE．coliRosetta(DE3)inducedbyIPT

7、G．ThepurifiedrBmBras2WasobtainedthroughNi计affinitychromatography．ThenthisrecombinantBmBras2Wasusedasanantigenforpreparationofrabbitpolyclonalantibody．AfterpurifiedwitlltheProteinAliP,thetiterofthepolyclonalantibodiesreaches1：12，800measuredbyELISA．Theimmunoblottingresultsindicatedth

8、attheantibodyWasspecificto