家蚕emc蛋白的表达和功能分析

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1、浙江理工人学硕十学位论文摘要extramacrochaetae(emc)蛋白是一个螺旋．环．螺旋家族的蛋白，它不具有DNA结合能力，主要是通过与其它具有螺旋一环．螺旋结构的蛋白形成异二聚体而发挥其生物学功能。生物信息学分析家蚕emc基因(Bmemc)发现，该基因序列长429bp，编码142个氨基酸残基，预测分子量15．59kD，GenBank登录号为DQ311169。以家蚕蛹的eDNA为模板通过PCR扩增获得了Bmemc基因的全长ORF序列。PCR扩增获得的产物经EcoRI和HindIII双酶切后，插入质粒pE

2、T-28a(+)的相应酶切位点，构建重组表达载体pET-28a(+)．Bmemc。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选阳性克隆。用终浓度为1mM的IPTG诱导重组菌后，超声裂解菌体并作SDS．PAGE分析，结果发现在20kD左右的位置有一条特异性蛋白条带。融合蛋白以包涵体的形式存在，将超声裂解菌体后离心所得的沉淀用含4M‘尿素的溶解液溶解。收集溶解后的上清液，以镍柱亲和层析的方法纯化得到融合蛋白。经FPLC反相柱层析进一步纯化后，对目的蛋白进行质谱分析，测得该融合蛋白的分子量为19347Da。以纯化

3、所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰大白兔，制备了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗血清的效价可达1：12800以上。提取家蚕五龄幼虫的各组织和家蚕各发育时期的蛋白，用于Westernblotting实验。实验结果表明，Bmemc蛋白在家蚕的卵巢、精巢、头、中肠等组织中有表达；在五龄幼虫、蛾和蛹中都有表达，而在卵中未检测到明显的表达。提取家蚕四个发育时期和五龄幼蚕各组织的总RNA，利用荧光定量PCR的方法，对家蚕四个发育时期以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行分析，结果与Westernblotting结果相

4、符。此外，我们还用不同浓度和时间的Notch信号途径阻断剂处理家蚕Bm5细胞，之后提取细胞的总RNA并逆转录为eDNA。用荧光定量PCR的方法检测Bmemc基因的转录水平变化。结果显示，随着处理浓度的增加和处理时间的延长Bmemc基因的转录水平均呈现下降的趋势。基于我们的实验结果和前人的研究，我们推测家蚕Bmemc基因是Notch信号途径中的一个组分，其表达受到Notch信号途径的调控。关键词：Bmemc：Notch；组织定位；荧光定量PCR；Y分泌酶抑制剂浙江理I：人学硕士学位论文AbStractextram

5、acrochaetae(emc)isamemberoftheHelix··Loop·-Helix(HLH)superfamily．ItlacksthebasicregionthusisunabletobindDNAandisanegativeregulatorofotherbHLHproteinsbyforminginactiveheterodimerswiththem．TheBmemccDNAWas1619bpinlength，containinga429bpORF,whichencodeapolypepti

6、deof142aminoacids；themolecularweightofthisproteinWasestimatedtobe15．59kD．WeobtainedtheORFoftheBmemcfromthetotalcDNAofsilkwormpupabyPCR．AfterbeingdigestedwithEcoRIandHindIII，theDNAfragmentWasinsertedintothefusionexpressionvectorpET-28a．TheresultsofPCRanddiges

7、tionshowedthatthetargetfragmentWaSinsertedcorrectly．TherecombinantplasmidWastransformedintoE．coliBL21(DE3)．AfterbeinginducedbyIPTG,therecombinantproteinWasexaminedbySDS．PAGE．Themostrecombinantproteinwasinsolubleinclusionbody．Inordertoobtainabundantsolublerec

8、ombinantprotein，theinsolubleinclusionbodywassolubilizedwith4Murea．TherecombinantproteinWaspurifiedwithNi-affinitychromatography．ThemolecularweightoftherecombinantproteinWascharacterizedbymass—sp