GBT27538-2011-动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法.pdf

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1、ICS11．220B41a雷中华人民共和国国家标准GB／T27538--2011动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法Animalinfluenzadetection--MethodofpyrosequencingforHAandNAininfluenzavirusA(H1N1)2011-11-21发布2012—03—01实施宰瞀鹳紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T27538--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化

2、技术委员会(sAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、朱来华、张鹤晓、单虎。1范围动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法GB／T27538--2011本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型HINl流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸序列检测方法。本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期

3、的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求NY／T541动物疫病实验室检验采样方法SN／T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ATP：三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)PBS：磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelaneedsolution)Pyr

4、osequencing：焦磷酸测序RT-PCR：反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleieacid)Taq酶：TaqDNA聚合酶4原理焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APs)、荧光素孵育，逐一加人四种dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi)；ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动

5、荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰。每个光信号的峰高与反应中掺人的核苷酸数目成正比。ATP和未掺人的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。】标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27538--20115试剂和材料5．1除特别说明外，本标准所用试剂为分析纯或生化试剂，所有试剂均用无RNA酶污染的器具(用DEPC水处理)分装，实验用水符合GB／T6682的规定。5．2焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A。5．3AMV反转录酶。5．4TaqDNA聚合酶。5．5

6、PyroGoldSqAReagentsDNA序列分析试剂盒或其他等效试剂。5．6DNTPs。5．7琼脂糖(电泳纯)。5．8三氯甲烷。5．9异丙醇。5．1070％乙醇：配制方法见附录B。5．11DNA分子量标准品(100bp～2000bp)。5．12裂解液：Trizol或其他等效总RNA提取试剂。5．13PBS：配制方法见附录B。5．1410×PCR缓冲液：建议使用厂家提供，如需配制见附录B。5．15电泳缓冲液：配制方法见附录B。5．16溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg／mL。5．17电泳加样缓冲液：配制方法见附录B。5．18磁珠悬液。6仪器设备6．1焦磷酸测序仪。6．2焦磷酸测序仪96

7、孔板。6．3真空吸附器。6．4PCR仪。6．5冷冻离心机(最大离心力120009以上)。6．6微量移液器。6．7电泳仪。6．8紫外检测仪。6．91．5mLEppendorf管。7采样和样品制备7．1采样按照NY／T541和GB／T18088选取样品。样品处理和其他实验活动符合GB19489的有关规定。7．2样品处理7．2．1鼻腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，30009离心5rain，取上清液2GB／