合成ⅱa类广谱细菌素乳酸菌筛选及合成和分离地研究

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1、国内图书分类号：TS201.3学校代码：10213国际图书分类号：664.6密级：公开工学博士学位论文合成Ⅱa类广谱细菌素乳酸菌的筛选及合成和分离的研究博士研究生：刘文丽导师：JohnShi副导师：张兰威申请学位：工学博士学科：化学工程与技术所在单位：食品科学与工程学院答辩日期：2014年06月授予学位单位：哈尔滨工业大学万方数据ClassifiedIndex:TS201.3U.D.C:664.6DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringSCREE

2、NINGOFLACTICACIDBACTERIAPRODUCINGBROADSPECTRUMCLASSIIABACTERIOCINANDPRODUCTIONIMPROVEMENTANDSEPARATIONOFBACTERIOCINCandidate：LiuWenliSupervisor：JohnShiDeputySupervisor:ZhangLanweiAcademicDegreeAppliedfor：DoctorofEngineeringSpeciality：ChemicalEngineer

3、ingandTechnologyAffiliation：SchoolofFoodScienceandEngineeringDateofDefence：June,2014Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology万方数据万方数据摘要摘要Ⅱa类细菌素是一种对单增李斯特氏菌具有强烈的抑菌活性，且在N端具有YGNGVXCXXXXCXV保守序列的细菌素，乳酸菌产生的Ⅱa类细菌素由于具有抑菌谱广、稳定性高、分散性好、安全高效、能作为天然

4、防腐剂等优点而倍受关注。但乳酸菌产生的广谱Ⅱa类细菌素的传统筛选方法的费时、费力、不能直接鉴定为Ⅱa类细菌素，分离纯化步骤繁琐，生物合成量低是限制其产业化的三大瓶颈。如果能够建立一种快速简捷的筛选方法直接鉴定Ⅱa类细菌素、缩短分离纯化步骤、提高其生物合成量，对Ⅱa类细菌素的产业化应用具有重要意义。本论文以实验室前期收集、筛选保存的乳酸菌为研究对象，对其进行了具有广谱抑菌活性乳酸菌细菌素的筛选，建立了直接鉴定Ⅱa类乳酸菌细菌素的平台，提高了筛选得到的具有广谱抑菌作用的Ⅱa类乳酸菌细菌素的生物合成量

5、，建立了Ⅱa类乳酸菌细菌素的新的快速分离工艺，研究了Ⅱa类乳酸菌细菌素的理化性质。利用琼脂扩散法对实验室保存的142株乳酸菌进行了具有广谱抑菌活性的产细菌素乳酸菌的筛选，经过排除有机酸、过氧化氢及蛋白酶验证，最终筛选出菌株IN3432、Y31、Y33、IN3521、IN3922、SP1.1、94.3、IN3821共8株乳酸菌具有产广谱乳酸菌细菌素的能力。基于Ⅱa类细菌素在N端具有YGNGVXCXXXXCXV保守序列的特征，建立了基于YGNGV-位点的直接鉴定产Ⅱa类细菌素乳酸菌的高通量筛选平台；

6、利用此平台从上述8株产细菌素的乳酸菌中鉴定出3株乳酸菌（Y33、Y31、SP1.1）具有产Ⅱa类细菌素的能力。其中菌株Y31和菌株Y33与Genebank数据库中的Ⅱa类细菌素的基因编码序列同源性最高，综合菌株Y31的抑菌活性最强且相对更为稳定，所以选择菌株Y31进行后续进一步的研究。经菌落、菌体形态、API生理生化及16SrDNA鉴定菌株Y31为屎肠球菌Enterococcusfaecium。利用化学定义培养基来培养产Ⅱa类细菌素乳酸菌EnterococcusfaeciumY31，不添加任何蛋

7、白质和肽，单纯通过调节各种化学定义培养基的纯的氨基酸成分、维生素和矿物质等成分，提出了一个能提高细菌素EnterocinY31产量的新方法；研究结果表明产Ⅱa类细菌素乳酸菌EnterococcusfaeciumY31的生长与细菌素EnterocinY31产量没有直接的线性关系；利用缺一交叉试验确定了提高细菌素EnterocinY31产量的新的化学定义培养基SDM；比较SDM中EnterocinY31的产量和MRS中EnterocinY31的产量，发现SDM中EnterocinI万方数据哈尔滨工业

8、大学工学博士学位论文Y31的产量是MRS中EnterocinY31的产量的1.6倍。发现了利用化学定义培养基-超滤联合优化Ⅱa类细菌素生物合成量后，细菌素EnterocinY31的分离纯化更为简便，仅为超滤和电泳两步，并将其新的分离纯化方法与常规的分离纯化方法（细胞膜吸附、离子交换色谱、透析、疏水层析、反向色谱）纯度和得率进行了比较，化学定义培养基-超滤的回收率为80%，而常规的分离纯化方法为6.4%，化学定义培养基-超滤方法比常规方法提高了12.5倍，纯度都达到了质谱测序要求，化学定义培养基-