基于液质联用法的蛋白绝对定量技术开发及其在单抗类药物临床前药代动力学研究中的应用

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存

2、、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要杂交瘤细胞技术的建立使得针对特定抗原，具有良好特异性和高度均一性的单克隆抗体的大规模生产成为可能，而在基因工程研究中涌现的技术突破则为抗体人源化和全序列人抗体的研究奠定了基础，使得医用单克隆抗体成为当今药物研发的热点之一。相较于小分子药物，单克隆抗体能特异而高效地识别并结合靶点，具有药效强，副作用小和药物半衰期长等优势，在肿瘤、自身免疫性疾

3、病、慢性炎症反应、器官移植排斥及病毒感染等的治疗中获得广泛应用。而在药物研发过程中，可靠，精准且灵敏的分析定量方法必不可少。现有定量方法的金标准，酶联免疫吸附测定法虽然具有操作简便，检测限低且通量高的长处，但也存在结果重现性差，线性范围窄，复杂基质的内源性干扰等弊端。在小分子定量领域应用成熟的液质联用法被引入到抗体等蛋白的定量操作中，并展现出光明的前景。能够高通量，高灵敏度地测定多肽序列，鉴定蛋白的质谱已是蛋白组学研究中不可或缺的鉴定手段，样品处理方法的革新和加速数据处理的生物信息学软件的涌现，使得液质联用法在定量蛋白组学

4、中同样应用日增。但受制于现有蛋白分离方法和质谱检测范围，除少数个例，将单一目标蛋白从复杂基质中充分分离，并直接定量仍极具挑战性；因此，将生物样品蛋白酶解，通过测定酶解产物中指纹肽浓度来间接定量目标蛋白水平的自下而上策略，即鸟枪法，发展迅速。在绝对定量蛋白组学中，在生物基质中能够唯一指向目标蛋白的指纹肽，含有酶解位点的指纹肽衍生物和标准蛋白都曾用于制备标准曲线，而对应的同位素标记物也用作内标以校正定量结果的偏差。但这些不同的标准曲线对生物基质中同一目标蛋白定量结果的准确度的影响，以及对应的同位素内标对定量结果的偏差的校正效果

5、，尚无系统性的比对研究；同时，鸟枪法用于定量蛋白组学的基础，即指纹肽的筛选和确证还没有被广泛接受的标准和流程。针对定量蛋白组学中自下而上的鸟枪法的上述不足，在本论文的工作中了建立完整的目标蛋白指纹肽筛选，肽段鉴定搭建纳升色谱与线性离子阱/轨道阱杂交质谱系统作为肽段鉴定平台。目标蛋白经牛胰蛋白酶水解后，经纳升色谱分离通过纳升喷雾即NanoESI进入杂交质谱系统，获得线性离子阱质谱和高分辨的静止轨道阱质谱联动分析，通过搜索数据库列出质谱检测到的所有肽段，并确定其在特定生物基质中的候选指纹肽列表；使用低流速色谱与三重四级杆质谱系

6、统建立蛋白定量平台评估候选指纹肽，通过在线正交试验设计优化候选指纹肽的SRM参数并评估其稳定性，比较不同候选指纹肽的灵敏度，以得到最佳指纹肽万方数据及其最优SRM参数用于定量。此二平台被成功用于anti-HCV单抗的指纹肽筛选和最佳指纹肽SRM参数的优化，并系统性地研究了使用指纹肽，指纹肽衍生物和单抗本身制备标准曲线，和不同的稳定同位素标记内标时，对anti-HCV单抗在大鼠血浆这一生物基质中定量结果的影响；同时，利用此平台也成功建立起基于液质联用法的cT84.66单抗绝对定量方法，并将其应用于cT84.66的临床前药代动

7、力学研究。关键词：单抗定量蛋白组学鸟枪法液质联用法临床前药代动力学万方数据ABSTRACTTheTheestablishmentofhybridomaplatformprovideslarge-amountofmonoclonalantibodywithhighlyspecificityandhomogeneityagainstspecificantigens,andthetechniqueinnovationandimprovementinantibodyengineeringhelptheinvestigationan

8、dresearchinchimericantibodyandfull-humanantibody,whichmakethetherapeuticmAboneofhotspotsinmedicalR&D.Comparedwiththeconventionalsmallmoleculardrugs,them