亲水疏水复合膜固定化脂肪酶手性拆分布洛芬的研究

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1、亲水-疏水复合膜固定化脂肪酶手性拆分布洛芬的研究胡彧，王玉军*，高思亮，骆广生，戴猷元（清华大学化工系化学工程国家重点联合实验室）摘要:布洛芬是一种广泛应用的解热镇痛药，其分子具有手性。酶法动力学拆分利用脂肪酶催化布洛芬酯不对称水解实现手性对映体的分离。由于脂肪酶具有特殊的界面特性，因此，复合膜作为脂肪酶固定化的载体有很大优势。本文提出了利用亲水-疏水复合膜固定化脂肪酶手性拆分布洛芬的方法。其中，疏水层为PTFE材料的疏松多孔层；亲水层为CA材料的致密超滤层。使用复合酶膜反应器对固定化酶催化布洛芬乙酯不对称水

2、解的操作条件和规律进行了研究。通过对底物浓度、酶用量、温度、pH条件的研究，得到了反应最佳操作条件。同时，通过与乳液体系实验的对比，发现固定化酶酶活保留率达65%以上，半衰期达183h，比游离态酶增长约384.4%。进一步证明了固定化酶用于催化布洛芬手性拆分的优势。关键词:布洛芬手性拆分复合膜脂肪酶固定化1.概述布洛芬（Ibuprofen）是一种广泛应用的非甾体类解热镇痛药，药效显著、毒副作用小，已成为全球最畅销的非处方药之一[1，2]。布洛芬分子具有手性，常规方法合成的布洛芬分子是手性对映体S-(+)-布洛

3、芬和R-(-)-布洛芬的等量混合物。药理研究表明[3，4]，S-(+)-布洛芬的药理活性是R-(-)-布洛芬的约160倍，而布洛芬的毒副作用却主要由R-(-)-布洛芬引起的，因此，对布洛芬进行手性拆分具有很强的实际意义。目前广泛应用的布洛芬的手性拆分工艺主要通过脂肪酶催化外消旋布洛芬酯不对称水解实现，其正反应式如下[4]：图1布洛芬酯的酶促水解反应由于某些脂肪酶催化(S)-布洛芬酯水解的速率远远大于(R)-布洛芬酯，且(S)-布洛芬在水中有更大的溶解度，因此能够实现布洛芬的手性拆分。酶的优势是高效，低能耗，条

4、件温和专一性强，但也具有对环境敏感、只能催化间歇反应和回收困难的缺点，为了解决这些问题，引入了酶的固定化。本文中，采用了一种亲水-*通讯联系人：王玉军，清华大学化工系副教授，E-mail:wangyujun@mail.tsinghua.edu.cn疏水复合膜作为酶固定化的载体，通过超滤截留的方式进行固定化。图2PTFE/CA亲水-疏水复合膜截留固定化酶过程2.实验2.1实验方法取一定量布洛芬乙酯，溶于适量异辛烷中作为有机相；使用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液作为水相。利用恒温水浴夹套反应器控制温度为酶的最

5、佳活性温度40℃。负载有脂肪酶的复合膜将膜器分隔为两腔。以柱塞泵驱动反应液在两腔中逆流流动。CA亲水层和PTFE疏水层分别与水相和有机相接触。同时，采用未经固定化的游离态酶进行对比实验，布洛芬产物浓度通过高效液相色谱进行分析。文章研究了不同操作条件（pH、底物浓度和单位膜面积酶负载量）下反应速率与手性拆分效果的影响，得到的结果如下图：0.012120.010膜体系0.00810乳液体系乳液体系S0.006乳液体系RE0.004膜体系S8膜体系S0.002Activity/mol/h/g-protein0.00

6、060.00.10.20.30.40.50.60.00.10.20.30.40.50.6C/mol/LCS/mol/LS底物浓度对反应速率与手性选择性的影响0.0010120.0008S100.0006RE0.000480.0002Activity/mol/h/g-protein0.000060.00.51.01.52.02.501234562Ce/g/LEnzyme/g/m酶用量对反应速率与手性选择性的影响0.0012110.0010乳液体系10膜体系0.0008乳液S90.0006乳液RE膜S80.000

7、4膜RActivity/mol/h/g-protein0.000270.00006.57.07.58.08.59.066.57.07.58.08.59.0pHpHpH对反应速率与手性选择性的影响图3操作条件对于手性拆分效果的影响研究结果表明，底物浓度、单位面积酶负载量、温度和pH对脂肪酶手性拆分布洛芬的反应速率和手性选择型均有一定影响。对于固定化酶，最佳操作条件为底物浓度2CS=0.35mol/L，基于膜面积的酶负载量m=0.7-1g/m，pH=8.0。2.2酶活保留率固定化酶由于空间位阻、活性位点屏蔽、高级

8、结构扭曲等原因，其活性一般有所下降。CA和PTFE都是高生物相容性材料，亲水-疏水的微结构又能较好地消除传质阻力。因此使用CA/PTFE复合膜固定化酶能较好地保留酶活。下图是以乳液体系相同条件为基准，在膜体系的最适反应条件下反应12h过程中的不同酶负载量下固定化酶平均酶活保留情况曲线：1.21.0酶活保留率0.80.60.4Activityreserverate0.20.00.00.51.01.52