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1、DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞效果和机制研究［摘要］目的：探讨体外培养条件下DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的效果与机制。方法：取兔股骨，骨髓腔进行冲洗，采用全骨髓法分离纯化培养BMSCs,培养至第3代后，分别利用诱导培养液（组A）,添加DA-2006的培养液（组B）以及普通培养液（对照组）培养BMSCs,采用嗟吐蓝（MTT）检测3组骨髓基质干细胞增殖能力，利用荧光定量PCR技术检测骨碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（0C）、骨桥蛋白（OPN）等成骨性标志基因的表达情况。结果：经过诱导后，组B细胞具有
2、良好的形态，扩增能力迅速。在生长率方面，诱导组B较强于诱导组A,对照组团块化程度最低。对照组的表达量最低，同时组E的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（P2结果2.1细胞形态学情况细胞生长的形态学特点如下：具有良好状态，具有梭形形状，且放射状生长，细胞间贴附紧密，70%细胞沿细胞体的长轴排列有序（见图1）,细胞具有良好的纯度。通过0.25%胰蛋白酶消化后，传代培养的骨髓基质干细胞生长明显速度增加。但传至20代左右，生长速度会逐渐减慢，细胞内产生颗粒状的堆积物。图1传代第3代骨髓基质干细胞（X100）2.2生长率情况该实验分
3、为诱导组A,即诱导培养液组，诱导组B,即含DA-2006的培养液组，对照组，即普通培养液组。通过MTT法，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线（见图2）3组实验进行一周的细胞培养后，3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A,对照组团块化程度最低（B组相比于A组,F=0.152,P=0.453）,说明组B的诱导能力高于其他两组，但是无明显差异。图2骨髓基质干细胞生长曲线图2.3成骨分化标志基因表达情况标志骨髓基质干细胞的成骨分化的基因有ALP［5］、0C、OPN,这些基因在骨形成中担当着重要作用。通过荧光
4、定量PCR技术，检测这3个标志基因在添加有诱导培养液或者含DA-2006的培养液的条件下的表达变化（见图3）。结果显示对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（X2=3.621,6.521,4.052,P=0.012,0.000,0.009)o图3骨髓基质干细胞的成骨分化标志基因表达情况3讨论当前骨髓基质干细胞已经被实验证实其作为载体在细胞治疗和基因治疗方面的价值［6-7］。骨髓基质干细胞相对较容易从骨髓中抽取分离，同时较容易进行体外细胞培养及转染多种外源基因。因此，骨髓基质干细胞相比HSCs在基因
5、治疗方面有更多优势[8-10],例如HSCs的分离需求大量的骨髓，并且这些细胞是很难大批量体外培养的。经典的诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的方法包括流式细胞仪分离技术，密度梯度离心法，贴壁筛选法[11-12]o操作较简单的方法为贴壁筛选法，该法筛选的细胞容易成活。在细胞培养过程中，换液次数减少可以保护骨髓基质干细胞的活力。多巴胺受体可能作为肿瘤干细胞的生物标志物。将人脐带间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子的表达情况，研究指出，脐带间充质干细胞经诱导后可向多巴胺能神经元分化，且分化后的细胞可表达脑
6、源性神经营养因子。而对于诱导骨髓基质干细胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]进行诱导，本实验探讨人工合成的小分子化合物DA-2006的诱导作用及其机制。结果显示3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A,对照组团块化程度最低,而且诱导组B的密集程度最高，说明含DA-2006的培养液条件下的骨髓基质干细胞的细胞活性比较强，该结果也验证了增值与分化的矛盾统一原理[14-15]o人类的骨质是由成骨细胞进行骨质的累积和破骨细胞进行骨质的降解相平衡的一个完美的平衡过程。近年来科学家发现ALP
7、、OC、OPN参与了肿瘤形成、细胞增殖和分化、病毒防御等几乎所有的生物学过程，它可能有非常广泛多样的生物功能。本文通过荧光定量PCR实验，检测骨髓基质干细胞在诱导分化后的相关成骨标志基因的表达变化，可以反应其成骨分化水平，骨碱性磷酸酶(LAP)作为成骨细胞表型的标志物之一[16,17],可反映成骨细胞的活性和功能状况，主要应用于小儿佝偻病早期诊断，骨源性碱性磷酸酶从骨质中分泌，当骨头中钙盐沉淀出现不足时，分泌会增多，骨中钙盐充足则分泌减少。同时相关研究显示，在干细胞诱导分化为成骨细胞时，OPN与0C的表达水平显著上调。本文结果
8、显示，对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组Ao可能机制在于作为干细胞一种开关的多巴胺能控制成骨中新细胞的形成。如果多巴胺信号被抑制，它们就不能产生新的成骨细胞。总之，本研究探讨了DA-2006对骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞的作用及分子机制。研
