猪圆环病毒ⅱ型orf2和猪il-2基因重组猪伪狂犬病毒的构建

《猪圆环病毒ⅱ型orf2和猪il-2基因重组猪伪狂犬病毒的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河南农业大学2012届硕士学位论文摘要猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，其基因组为单股环状DNA，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称。PCV分PCVl和PCV2两种基因型。猪圆环病毒病(PCVAD)自二十世纪九十年代初期首次报道以来，美国、法国、日本、韩国等国家相继报道该病的发生，目前该病已成为世界范围内危害严重的疾病之一。PCV2除引起猪体发生原发感染甚至死亡之外，还侵害猪的免疫系统，导致免疫抑制，继发其他的细菌或病毒感染，使疫情加重，给世

2、界养猪业造成了巨大的经济损失。因此，本研究以编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因为研究对象，以伪狂犬病毒弱毒疫苗株HB98株为亲本毒，构建了表达ORF2和IL-2基因的重组伪狂犬病毒，为探索开发PCV2重组疫苗奠定基础，从而为生产上PCV2的防治提供新的思路和理论依据。本研究根据GenBankqb己发表的PRV基因序列，设计并合成了一对特异性引物，采用PCR方法扩增PRV基因，并将其进行克隆和测序。对伪狂犬病病毒闽A株基因组DNA3．1kb片段的质粒pMD．PD用印厅I和碑朋l消化，将含gG全基

3、因及其上游pK基因、下游gD基因部分编码区约2．8kb的片段亚克隆到载体pUCl9qb，获得重组质粒PUPD。以pcDNA3．1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到质粒PUPDBamHI和n订位点，构建重组质粒PUPDS。通过酶切、补平、连接的方法对PUPDS署IIpEGFP．nl载体质粒进行改造，消除了质粒PUPDS上的HindlII酶切位点，将改造后的质粒PUPDS命名为PH。并消除了质粒pEGFP—nl上的BamHI和nfl酶切位点，将改造后的质粒p

4、EGFP-nl命名为pEGFP—P。根据pEGFP-nl基因序列设计一对引物，分别在引物的上、下游5’端引入了风fI酶切位点，以质粒pEGFP．P为模版，通过PCR扩增技术将目的基因EGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40Poly(A))克隆入pMDl8-T载体内，构建了重组质粒。经酶切乘IPCR鉴定证明插入片段是EGFP基因，并将重组质粒命名为pMD-EGFP。用PstI酶切重组质粒pMD-EGFP和载体PH并回收，将载体PH去磷酸化后与目的片断EGFP连接，通过PcR扩增、酶切、序列测

5、定，证实该转移载体构建成功，并将其命名为PG。用BamHI酶切克隆有ORF2基因的质粒538．ORF2和载体PG质粒并回收，将载体PG去磷酸化后与目的片段ORF2基因连接，构建了重组质粒PGO。通过PCR扩增、酶切、序列测定证明，该转移载体构建成功。经酶切鉴定证明插入片断是ORF2基因片断，并证明插入方向正确。以pIRES．plL2为模板，通过PcR扩增约0．5kb的猪lL．2全基因，并将其克隆到质粒PGO中，构建重组质粒PGOIL2。然后再将该质粒与PRV基因缺失株HB98株基因组共转染ST细

6、胞，通过同源重组，构建了同时表达PCV2ORF2基因和猪IL．2基因的重组伪狂犬病毒株。经荧光检测和PCR鉴定，结果表明重组病毒构建成功。关键词：猪2型圆环病毒；ORF2基因；白细胞介素．2；重组伪狂犬病病毒河南农业大学2012届硕士学位论文ConstructionofarecombinantpseudorabiesvirusexpressingORF2geneofPorcineCircovirusType2andPorcineInterleukin-2geneSupervisor：Associ

7、ateProf．ChenHong··yingandProf．CuiBao．-anMasterCandidate：ZhuQian—leiABSTRACTPorcinecircovirus(PCV)iSasmallanimalviruswithasingle．strandedcircularDNAgenome，whichiSicosahedralandnonenveloped．PCVcontainsPCV1andPCV2．Porcinecircovirus．associateddisease(PCV

8、AD)wasfirstdescribedintheearly1990sandsubsequently，intheUSA，France，Japan，Koreaandothercountries．PCV2couldcauseprogressiveweightloseandhi曲wasting，intheotherhandthevirusproliferatesintheimmunesystemofpiglet，andcausedisorderofimmunefunction．Thevirushasc