猪圆环病毒ⅱ型cap基因与il-18基因重组禽痘病毒的构建

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1、河南农业大学硕士学位论文猪圆环病毒Ⅱ型CAP基因与IL--18基因重组禽痘病毒的构建姓名：王子馨申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：陈红英201205河南农业大学2012届硕士学位论文中文摘要猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是迄今为II_=发现的一种最小的动物病毒，其基因组为单股环状DNA，病毒粒子无囊膜，晕二十面体对称。PCV可划分为PCVl雨1PCV2两种基冈型，其中PCVl基因组全长1759bp，无致病性，但J’+泛存在于猪体和猪源细胞系，首先由Tischer丁．PK一15细胞中发现；PCV2基l灭

2、组长1767bp或1768bp，被

3、认为是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原。PCV2有两个主要的开放阅读框(ORF)：ORFl和ORF2，ORF2基冈编码该病毒的结构蛋白，是区分PCVl平¨PCV2的重要区域。我国丁．2000年首次发现了PCV2的存在，该病毒在我国猪场中感染率高，猪群的平均附

4、生率一般都人丁．20％，有的甚至超过50％，有些地

5、又：高达100％，可以说目前该病毒己在我国猪群中普遍存在，每年冈PCV2感染造成经济损火达数亿元。为了构建PCV2CAP基冈重组禽痘病毒，将其弧克隆剑含有LP2EP2早晚

6、期启动子的载体pSY538的BamHI位点，将带有痘卣病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到质粒pS9681的SfiI位点，然后切卜．含有LP2EP2启动子的CAP片段再砸克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotI位点，用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S—FPV一017株的鸡胚成纤维细胞，在含有x—gal的营养琼脂培养基上进行监斑筛选，获得重组病毒rFPV—CAP，通过PCR干II酶切进行鉴定。结果表明获得包含有PCV2CAP基冈的禽痘病毒并且具有稳定的遗传性状。以间接免疫荧光法证实感染rFPVCAP的CEF中存在表达的CAP蛋白，为研发PCV2病毒重组禽痘病毒疫苗奠定

7、了基础。共表达PCV2CAP基冈与猪IL一18基冈的重组禽痘病毒的构建，将含有LP2EP2启动子的IL—18基冈克隆至含有CAP基冈的重组禽痘病毒rFPV—S1的上游，JLI』脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S—FPV一017株的鸡胚成纤维细胞，在含有x—gal的营养琼脂培养基上进行监斑筛选，获得重组病毒rFPV—CAP—IL一18，通过PCR和酶切进行鉴定。结果表明获得包含有PCV2CAP基冈利IL一18的重组禽痘病毒并且具有稳定的遗传性状。以间接免疫荧光法证实感染rFPV—CAP—IL一18的CEF中存在表达的CAP蛋白。为开发利用IL一18的佐剂效应及构建共表达IL

8、一18基冈幂¨保护性抗原基因的重组禽痘病毒疫苗奠定基础。本研究成功获得了PCV2CAP基冈全序列；成功获得了重绢禽疸病毒rFPV—CAP并能袢CEF中进行真实表达。成功获得了重组禽痘病毒rFPV．CAP．IL．18。为开发利刚IL．18的佐剂效应及构建共表达IL．18基因和保护性抗原基冈的重组禽痘病毒疫苗奠定基础。关键词：猪圆环病毒；CAP基冈；IL一18；重组鸡痘病毒河南农业大学2012届硕上学位论文ConstructionofRecombinantFowlpoxVirusCo—expressingPCV2CAPGeneandthePigInterleukin一18Ge

9、neSupervisor：Hong—YingChenMasterCandidate：Zi-XinWangABSTRACTPorcinecircovirus(PCV)isasmallanimalviruswithasingle—strandedcircularDNAgenome，whichisicosahedralandnonenveloped．PCVcontainsPCV1andPCV2．PCV1wasfirstdiscoveredbyTischerinporcinekidneycellculturePK一15，itis1759nucleotides，non-pathog

10、enic，butexistsinpigsandporcinecelllinewidely．However，PCV2genomeconsistsof1767or1768nucleotides，whichhasbeenassociatedwithpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)．Therearetwoopenreadingframes(ORF)inPCV2：ORF1andORF2．ORF2codesforstructuralprotein(CAPprotein)，itisa