nrf2在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中表达及莱菔硫烷保护作用机制研究

《nrf2在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中表达及莱菔硫烷保护作用机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河北医科大学硕士学位论文Nrf2在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中表达及莱菔硫烷保护作用机制研究姓名：李茹申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：郭力201203中文摘要Nrf2在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中表达及莱菔硫烷保护作用机制研究摘目的：多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病，目前其发病机制尚未完全明确，近年来许多研究表明，外源性与内源性亲电子物质所引起的氧化应激是多发性硬化脑损伤的重要机制之一。细胞内氧化物质具有氧化性，可导致细胞死亡，

2、因此细胞启动抗氧化应激系统保护神经元。Nuclearfactor-erythroid2relatedfactor2(Nrf2)为可与抗氧化反应元件(antioxidantresponseelement，ARE)结合的转录因子，其结合后可启动内源性抗氧化系统产生多种抗氧化酶，从而抑制氧化应激所造成的损伤。莱菔硫烷(sulforaphane，SFN)是一种异硫氰酸盐，以其前体萝卜甙形式广泛存在于十字花科植物中，多项研究证实，莱菔硫烷为Nrf2的重要激活剂，其可促进Nrf2核转位，与ARE结合j诱导II相解

3、毒酶表达产生抗氧化作用。由此可以推测，激活Nrf2／ARE通路可对EAE产生保护作用。莱菔硫烷对EAE的保护作用尚未有研究证明，莱菔硫烷诱导Nrf2核转位作用较强，副作用小，可透过血脑屏障，腹腔注射可被吸收，所以选择SFN进行试验，并与目前临床常用药物地塞米松(dexamethasone，DXM)比较以明确SFN是否具有保护作用及其强弱，以此证明SFN是否对MS有治疗价值。本实验成功建立了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EA

4、E)模型，测定了不同时间点小鼠脑组织中Nrf2及丙二醛(MDA)的表达水平，应用莱菔硫烷与地塞米松干预，观察莱菔硫烷与地塞米松对神经功能缺损评分、Nrf2和MDA的表达的影响，探讨Nrf2和MDA的表达规律与莱菔硫烷对EAE的保护作用。方法：1动物分组：将120只8．10周雌性C57BL／6小鼠，体重18．209，随机分为正常对照组，EAE组，莱菔硫烷组(50mg／kg)与地塞米松组(O．07mg／kg)；每组30只，每组又随机分为13天、20天、30天三个亚组，每个亚组10只小鼠。中文摘要2模型制备

5、：将抗原MOG35．55用生理盐水稀释成6mg／ml，并按1：l等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg／m1)混合，乳化后按每只0．1ml于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，免疫当天即第Oh及第48h腹腔注射O．5mlPTX(1400ng／只)。免疫当天记为0天，免疫在乙醚麻醉及充分固定下进行。SFN组与DXM组在免疫后第一天起分别给予相应剂量的药物进行腹腔注射，药物隔日注射一次直至动物处死为止，正常对照组及EAE组小鼠给予等量的生理盐水隔日腹腔注射。分别在第13天，20天，30天将动

6、物处死，留取脑组织与腰膨大，用免疫组织化学方法测定Nrf2在蛋白水平的动态表达。用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的动态表达。3神经功能评分：于动物免疫当日及免疫后每日上午8：oo时下午17：oo时对动物体重、活动状况、精神状态、皮毛光泽度进行观察，并对动物进行神经功能评分，Benson评分标准：O分：无任何临床症状；1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分：双后肢无力，被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；

7、5分：濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以土O．5计。4脑组织Nrf2表达的测定：将实验小鼠于免疫后第13天、20天、30天时麻醉后4％多聚甲醛固定，甲醛固定好后取脑组织，于4％多聚甲醛中保存24小时，石蜡包埋，组织切片，应用SP法进行免疫组化，光学显微镜下观察阳性细胞，并计数。5脑组织丙二醛的测定：将实验小鼠于免疫后第13天、20天、30天时麻醉后，立即断头在冰盘上快速取脑，剥除硬脑膜，去除小脑、脑干、额极及脑室周围皮层，在0．-一4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，准确称重，按1：9加入冰

8、冷生理盐水制成组织匀浆液，然后在冰浴中超声400安培，5s／次，间隙lO秒反复3-．一5次，2000r／min，4。C离心15min．取上清，置于．70℃冰箱中保存待测。结果：卜l动物发病率观察：EAE组、SFN组与DXM组小鼠发病率分别为：100％、33．33％、27．78％。EAE组小鼠的发病率高于SFN组与DXM组，差异有统计学意义(P