inos和opn在实验性自身免疫性脑脊髓炎中动态表达及依达拉奉保护作用研究

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1、河北医科大学硕士学位论文iNOS和OPN在实验性自身免疫性脑脊髓炎中动态表达及依达拉奉保护作用研究姓名：高倩申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：董梅201203中文摘要iNOS和OPN在实验性自身免疫性脑脊髓炎中动态表达及依达拉奉保护作用研究摘要目的：多发性硬化(multiplesclerosisMS)是一种以中枢神经系统炎性细胞浸润，白质脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病。目前MS的发病机制尚不清楚，可能与免疫，感染，遗传，环境等因素有关。目前MS尚无特效治疗药物，本研究目的在于建立MS动物模型实验性自身免疫性脑脊

2、髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)，研究诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在EAE中的动态表达，并使用依达拉奉注射液进行干预，研究其治疗作用。方法：1建立动物模型将动物麻醉，迅速取脊髓全长并称重，按全脊髓重量与冰盐水体积为l：10的比例，制成豚鼠全脊髓匀浆(GPSCH)，再与等量含6rag／ml卡介苗的完全福氏佐剂(CFA)充分混合，即为完全免疫抗原。将上述免疫抗原

3、按0．5ml／只于大鼠四肢足垫、背部皮下注射，免疫动物。2实验分组及干预将健康雌性Wistar大鼠70只随机分为三组，对照组10只，EAE组30只，依达拉奉干预组30只。根据预实验结果，在免疫后第10天，各组随机取5只大鼠作为发病前组，以后各组随机取发病后3天和发病后7天的大鼠各5只，记为3天组(高峰期组)和7天组(缓解期组)。自免疫当天起给予干预组大鼠依达拉奉注射液10mg·蚝-I．d-1腹腔注射，对照组和EAE组大鼠给予生理盐水lml／d腹腔注射直至处死。3神经功能评分自免疫当天起每只大鼠称重，观察大鼠的精神状态，进

4、食水情况，大小便情况及活动情况。按照Kono提出的标准，进行神经功能评分。4实验指标观察使用10％水合氯醛麻醉动物，将脊髓固定于多聚甲醛中，取脊髓腰膨大部分，制成蜡块，HE染色观察炎性细胞浸润情况，免疫组化染色观察iNOS和OPN阳性细胞数目。5统计学方法采用SPSSl3．0统计学软件进行统计学分析，计量资料使用中文摘要均数士标准差表示，多个计量资料均数比较使用单因素方差分析(One—WayANOVA)，组间两两比较使用SNK—q检验。计数资料的比较使用卡方检验，检验水准取a=0．05。结果：1动物发病情况的观察大鼠免疫

5、后逐渐出现精神萎靡，皮毛不光滑，食欲下降，体重减轻，发病时先出现尾部无力，继而出现后肢，前肢无力，大小便失禁，多数动物伴有双后肢关节肿胀。(1)起病时间的比较EAE组大鼠平均起病时间为(12．50-土1．52)天，依达拉奉干预组起病时间延长，为(15．67+1．37)天，两组比较有统计学意义(P<0．05)。(2)发病率的比较EAE组30只大鼠中发病24只，发病率80％，依达拉奉干预组30只大鼠中发病16只，发病率53．33％，两组比较有统计学意义(P<0．05)。(3)神经功能评分的比较EAE3天组(3．20士0．84

6、)，7天组(1．60-a：0．55)，相比有统计学意义(P

7、。(4)发病后第7天EAE组炎性细胞及血管袖套较前均减少，依达拉奉干预组炎性细胞较前减少，未见血管袖套。3免疫组化染色指标观察3．1iNOSiNOS主要表达在巨噬细胞，单核细胞等炎症细胞，小胶质细胞及少量的星形胶质细胞和神经元也表达iNOS，本研究主要计数炎症细胞。(1)发病前EAE组免疫阳性细胞数目(20．53+2．67)，依达拉奉干预组免中文摘要疫阳性细胞数目(14．13士2．88)，两组比较有统计学意义(P<0．05)。(2)发病后第3天EAE组免疫阳性细胞数目(22．60-士2．72)，依达拉奉干预组免疫阳性细胞

8、数目(16．93士2．89)，两组比较有统计学意义(P<0．05)。(3)发病后第7天EAE组免疫阳性细胞数目(11．334-2．26)，依达拉奉干预组免疫阳性细胞数目(10．60-土1．64)，两组比较无统计学意义(P>0．05)。(4)EAE组3个时间点两两比较：发病前组与3天组比较无统计学意义(P>0．05)。