rhbdd3分子在免疫应答调控中的作用及其机制研究

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1、第二军医大学博士学位论文Rhbdd3分子在免疫应答调控中的作用及其机制研究姓名：刘娟申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：曹雪涛201205Rhbdd3分子在免疫应答调控中的作用及其机制研究摘要第一部分Rhbdd3分子抑制TLR3介导的NK细胞活化及其机制研究天然免疫应答在机体抵抗病原体侵袭过程中发挥重要作用。NK细胞是一种重要的天然免疫细胞，通过释放多种细胞因子及杀伤性物质介导免疫活化和免疫监视，在机体抵抗感染和肿瘤发生过程中发挥关键作用。随着近年来对天然免疫应答中模式识别机制的认识不断深入，发现NK细胞也表达多种TLR，尤其是与T细胞、B细胞、单核细

2、胞相比表达更高水平的TLR3。已证实，当TLR3与其配体poly(I：C)相互作用后能以直接或间接的方式诱导NK细胞活化。大量研究表明NK细胞功能紊乱参与了多种炎症性疾病及自身免疫性疾病的病理过程。TLR3触发的NK细胞活化在肝脏炎症与损伤中发挥关键作用。因此，NK细胞活化受到免疫系统的精密调控，然而目前关于NK细胞功能负向调控机制的研究却并不深入。机体在生理情况下如何控制NK细胞不被过度活化以维持免疫稳态、避免免疫病理损伤的发生?是否存在新型的调控蛋白参与控制TLR3或其他信号介导的NK细胞活化?这些新型调控蛋白通过何种分子机制影响NK细胞活化，是否需要

3、其他免疫细胞或免疫分子的参与?对这些科学问题的回答不但有助于深入了解NK细胞如何受到严格调节以维持生理条件下的免疫稳态，而且为NK细胞过度活化引发的相关疾病的控制提供潜在的药物靶点。Rhbdd3分子属于一类含有Rhomboid结构域的蛋白家族，早期被称为垂体瘤凋亡基因(pituitarytumorapoptosisgene，PTAG)。本人在硕士课题研究中发现Rhbdd3分子能够通过控制DC成熟及抑制TLR触发的NF．r．B信号通路活化，抑制IL．6等炎症因子的释放，维持体内Treg与Thl和T1117的平衡，进而在整体水平上抑制自身免疫性疾病的发生。本课

4、题中，我们研究了I地bdd3分子是否在TLR3介导的NK细胞活化过程中也具有调控作用，并迸一步研究了其信号转导机制及其对NK细胞介导的TLR3触发的急性肝损伤的抑制作用。第二军医大学博士学位论文1．Rhbdd3分子负向调节TLR3触发的NK细胞活化首先，我们从体内外2个方面，研究Rhbdd3分子是否对NK细胞活化具有调控作用。体外实验发现，Rhbdd3"／"小鼠来源的脾脏细胞在poly(I：C)刺激后比野生型对照组分泌更高水平的IFN吖和IL．6，而在IL．12和IL一15刺激后分泌的IFN吖和IL．6水平与对照组相似；进一步发现，在poly(I：C)刺激

5、后R办6嬲手小鼠脾脏细胞中NKl．1+细胞表达的胞内granzymeB、perforin及IFN吖水平比野生型对照组明显增高，而IL．12和IL．15刺激后的表达水平与对照组相似，提示Rhbdd3分子能特异性调控TLR3介导的NK细胞活化。在体内实验中，分别给予Rhbdd3小和野生型小鼠体内poly(I：C)处理后，发现R肋嬲小小鼠肝脏中的NK细胞募集比野生型小鼠明显增多，且肝脏NKl．1+NK细胞的胞内granzymeB、perforin及IFN吖表达水平及对NK细胞杀伤作用敏感的YAC．1肿瘤细胞的杀伤活性均比野生型明显增强。综合上述体内外研究结果，表

6、明Rhbdd3分子能够负向调控TLR3触发的脾脏及肝脏中NK细胞的活化，并抑制NK细胞在病理情况下在肝脏的募集。2．Rhbdd3分子负向调控TLR3触发的NK细胞活化的机制(1)Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK细胞依赖于NK细胞与其他细胞的相互接触为了探讨Rhbdd3分子负向调控TLR3触发的NK细胞活化的机制，我们首先分离了DX5+脾脏NK细胞，发现在DX5+NK细胞单独存在的情况下，无论Rhbdd3"／"小鼠还是野生型小鼠来源的DX5+NK细胞在poly(I：C)刺激后都分泌相似低水平的IFN．丫，而无论有无poly(I：c)N激，Rhbdd3"／

7、-小鼠NK细胞杀伤活性均比野生型明显增强。考虑到在没有其他支持因素存在的情况下，单纯NK细胞在体外培养条件下极易凋亡，我们在培养体系中加入IL—12和IL．15来支持NK细胞的生存。结果发现在IL．12和IL．15支持下，小鼠DX5+NK细胞在poly(I：C)后分泌极高水平的IFN．-f；但是比较Rhbdd3乒小鼠与野生型小鼠来源的DX5+NK细胞，无论poly(I：c)N激与否，都分泌同等高水平的IFN吖。以上结果表明，在IL—12和IL．15存在的情况下，单独存在的NK细胞在TLR3配体刺激后能够发生明显的活化，但Rhbdd3分子不能够直接调控TLR

8、3诱导的NK细胞活化，需要其他因素的存在。由于脾脏包含多种细胞类型