耐碳青霉烯g-杆菌碳青霉烯酶基因、整合子和iscr1结构特征及基因分型研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文耐碳青霉烯G。杆菌碳青霉烯酶基因、整合子和ISCRl结构特征及基因分型研究Studyoncarbapenemasesgene，classIintegronandISCRIamongcarbapenem·-resistantGramnegativebacteria专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学孙静静芮勇宇教授吴晓蔓教授李林教授温旺荣教授曾方银主任技师郑卫东主任技师论文评阅人陈清教授陈茶主任技师2012年5月9日广州硕士学位论文耐碳青霉烯G．杆菌碳

2、青霉烯酶基因、整合子和ISCRl结构特征及基因分型研究硕士研究生：孙静静指导教师：芮勇宇教授摘要研究背景与目的近年来由于抗生素的广泛应用，细菌在抗生素的选择压力下耐药率不断提高，耐碳青霉烯G．杆菌的分离率也逐年升高。耐碳青霉烯细菌是对亚胺培南或者美洛培南抗菌药物耐药的细菌。革兰阴性(G．)杆菌是引起临床感染最常见的细菌，主要包括肠杆菌科(常见大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属)和非发酵革兰阴性杆菌(常见铜绿假单胞菌、不动杆菌属)。细菌对碳青霉烯耐药性不断上升和快速传播己成为临床感染治疗面临的重要难题，其耐药机制研究已

3、成为微生物领域关注的热点。导致细菌产生耐碳青霉烯的机制有很多种，其中耐药基因水平转移是细菌耐药性迅速产生及扩散的主要原因之一。耐药基因位于质粒、转座子、整合子或插入序列共同区(ISCR)等可水平转移的基因元件上，通过接合、转化、转导、转座等方式在不同菌株间水平传播。研究临床G．杆菌泛耐药菌的耐药机制，可以指导临床合理使用抗生素，为新型抗生素的研发提供理论基础，为预防传播提供依据。目前国内外可水平转移的耐药基因元件的研究，主要集中在可水平转移的碳青霉烯酶基因家族、可携带多种耐药基因盒的整合子、可携带多种耐药基因盒且传

4、播能力更强的插入序列共同区(ISCRl)的研究。碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南或美罗培南的一类p内酰胺酶，摘要包括Ambler分子结构分类的A、B、D三类酶。其中B类为金属B内酰胺酶，简称金属酶，属于Bush分类中的第3组，按来源可分为天然金属酶和获得性金属酶，前者由染色体编码，后者多由质粒编码，主要见于铜绿假单胞菌、不动杆菌属和肠杆菌科细菌。A、D类为丝氨酸酶，分别属于Bush分类中的第2f和2d亚组，A类酶主要见于肠杆菌科细菌，D类酶(OXA型酶)主要见于不动杆菌属。由产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行

5、，有时使治疗陷入无药可用的境地，给临床抗感染治疗带来极大地挑战。以往一直以耐碳青霉烯类抗生素非发酵革兰阴性杆菌感染的报道为主，近几年世界各地均报道出现耐碳青霉烯抗生素的肠杆菌科细菌，尤其在肠杆菌科细菌中发现携带新德里I型金属D内酰胺酶(NDM．1)、KPC的菌株而备受关注。整合子可通过对基因盒的捕获和剪切使基因盒发生移动，自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上使整合子发生移动。整合子是细菌特别是革兰阴性菌基因中，一种能识别且俘获移动性基因盒，并有位点特异性的重组表达系统。整合子本身无法移动，但常出现在转座子、接合

6、性质粒、噬菌体或细菌染色体上，共同做为自身移动的载体，捕获和整合耐药基因，形成巨大的多基因座，并随细菌的繁殖复制到子代DNA中。典型的整合子结构由3部分组成：5’保守区(57conservedsegment,5"CS)、37保守区(37conservedsegment，3'CS)和两者之间的可变区(variableregion)。整合子57保守区包括编码整合酶(integrase，IntI)的基因(intI)、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)。其中Pant位于Intll的编码框内，有的整合子还

7、有启动子P2。整合子常根据intI基因序列进行分类，目前已被分为10类，1类整合子最常见，从临床菌株中发现的整合子大多属于此类。整合子可变区带有不同数量的基因盒，大部分是编码各种抗生素抗性的耐药基因盒。l类整合子的37保守区包括3个开放阅读框(ORE)：磺胺耐药基因(sull)，季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacEAl)及功能不明的ORE5。ISCR是由“insertionsequences’’(ISs)和“commmonregions”(CRs)得来。它既可具有插入序列的特点，也具有共同区的特点。IS属于高度

8、可移动性转座因子，对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子片段，并常可以移动II硕士学位论文邻近的基因。ISCR是一类IS91．1ike因子家族的成员，缺少反向重复序列，通过滚环方式转移邻近的耐药基因’。ISCR成员中ISCRl研究最为广泛，它常出现在复杂性I类整合子。ISCRl介导一系列的转座事件发生，转座不同长度的耐药基因，如eatA2、dfrA、q