耐碳青霉烯g杆菌碳青霉烯酶基因、整合子及iscr1组织特性及基因分型分析

《耐碳青霉烯g杆菌碳青霉烯酶基因、整合子及iscr1组织特性及基因分型分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、耐碳青霉烯G杆菌碳青霉烯酶基因、整合子及ISCR1组织特性及基因分型分析第一部分碳青霄烯酶基因研究1.1材料2009年6月~2011年6月广州南方医院检验科微生物室分离369株非重复耐亚胺培南或美洛培南的G-杆菌，利用BDpheonix100全自动微生物分析仪器进行菌株鉴定和药敏实验，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603>金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853。其中，肺炎克雷伯菌9株，不动杆菌属201株，铜绿假单胞菌159株。所有收集的菌株都及时用纸片法收集并-8(rc低温保存。2.PCR实验

2、对照菌株NDM、KPC、VIM、IMP、GIM、SPM、OXA基因阳性对照菌株均为PCR扩增阳性且测序验证菌株，所有的阳性对照均经PCR扩增阳性并测序验证，阴性对照菌株大肠埃希菌ATCC25922。1.1.2主要的培养基及缓冲液1.LB液体培养基lOg细菌培养用胰蛋白胨(baeto-trytone)，5g酵母提取物(bacto-yeastextract),lOg氯化钠，加入去离子水至800ml,撞拌至溶质完全溶解，用5mol/LNaOH调节pH值至7.4，加入去离子水至总体积为1L，每5ml一瓶分装，151bf/in2(1.034X105Pa)高压灭菌20分钟

3、。2.LB固体培养基：向LB液体培养基中加入159/L琼脂糖，151bf/in2(l.034X105Pa)高压灭菌20分钟。冷却至5(rC，直接铺制平板。培养基完全凝固后，倒置平板并储存于4°C备用。3.5XTBEje存液：54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)，力口去离子水至1L。0.5XTBE缓冲液：5XTBEC存液用去离子水稀释10倍使用。4.Imol/LTris-HCI溶液(pH8.0)的配制：在800ml离子水中溶解121.91gTris碱，加入浓HC1调节pH值至所需值(pH8.0时，浓HCI约42

4、ml)，应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加去离子水定容至1L，分装后高压灭菌。5.0.5mol/LEDTA(pH8.0)：在800ml离子水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠，在磁力损拌器上剧烈搜拌，用NaOH调节pH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌。6.10%十二焼基硫酸钠(SDS):在900ml去离子水中溶解lOOg电泳级SDS,加热至68°C助溶，加入几滴浓HCI调节pH值至7.2，加去离子水定容至1L，分装备用。7.缓冲液I(TEI):配制400ml，吸取Imol/LTris-HCI溶液pH8.0)20ml和0.5mol/L

5、EDTA(pH8.0)溶液16ml，再加入蒸傾水至400ml，使Tris-HCI的终浓度为50mmol/L，EDTA的终浓度为20mmol/L。8.缓冲液II(TEII):按照配制400inl来操作。吸取Imol/LTris-HCI溶液(pH8.0)20ml和0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液1.6ml,再加入蒸馈水至400ml,使Tris-HCI的终浓度为50inmol/L,EDTA的终浓度为2mmol/L。9.缓冲液III(TEIII):按照配制400ml来操作。吸取Imol/LTris.HCI溶液(pH8.0)4ml和O.5mol/LEDTA(p

6、H8.0)溶液0.8ml,再加入蒸馈水至400ml，使Tris-HCI的终浓度为lOmmol/L，EDTA的终浓度为Immol/L。1.2方法1.2.1用SDS-蛋白酵K裂解，紛-氯仿方法抽提菌株基因组DNA用SDS-蛋白酶K-酷-氯仿方法提取细菌的基因组DNA。取保存的菌接种于LB(Luria-Bertani)肉汤复苏，37°C振荡6--8h;取适量菌液接种于LB平板，37°C过夜；挑取平板上的单菌落接种于LB肉汤，37°C振荡过夜增菌。取LB菌液1ml加于已灭菌的1.5mlEppendorf管中，离心lOOOOrpm,5min,收集

7、菌沉淀；用缓冲液I(50mmolTris-HCIpH8.0，20mmolEDTA)洗漆菌沉淀一次，离心8000rpm，5min,收集菌沉淀；将菌沉淀悬浮于适量缓冲液II(50mmolTris-HClpH8.0,2mmolEDTA),加入SDS终浓度为0.5%，加入蛋白酶K终浓度为200ug/ml,50°C水浴2h。用等体积盼:氯仿:异戊醇(25:24:1)，抽提两次，等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，离心8000rprn，5min。取上清液于已灭菌的Eppendorf管中，加入醋酸钠(pH5.2)终浓度为0.3mol/ml，加入2倍体积无水乙醇，

8、室温20min。离心12000rpm,