kgf--1的聚乙二醇n--不端定点修饰及修饰产物性能研究

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1、温州医学院硕士学位论文KGF--1的聚乙二醇N--不端定点修饰及修饰产物性能研究姓名：孙传传申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：李校堃2012-05-22温州医学院硕士学位论文KGF．1的聚乙二醇N．末端定点修饰及修饰产物性能研究中文摘要第一章KGF．1的PEG定点修饰目的：建立对KGF．1进行PEG定点化学修饰的工艺研究，优化两种常见修饰剂PEG-丁醛及PEG．马来酸酰亚胺(PEG．MAL)的修饰条件和分离纯化条件，对修饰后所得产物的活性、空间结构、稳定性、体内药动学性质、抗肝损伤作用等生物性能进行评价。

2、方法：选择PEG一丁醛及PEG．MAL作为化学修饰剂，对影响聚乙二醇定点修饰的5个主要影响因素：蛋白浓度、反应物的摩尔质量比、反应液pH值、反应温度和反应时间进行条件优化，设计一系列实验，摸索出能得到高修饰率和单修饰产物的修饰条件。根据PEG修饰对蛋白电荷的影响，利用离子交换色谱分离获得修饰蛋白。此外，为了判定PEG修饰KGF．1是否是单一修饰，我们采用了MALDI．TOF修饰前后蛋白的分子量进行比较测定：采用N．端测序即Edman降解的方法来确定KGF．1的N一末端是否被聚乙二醇分子所占据；采用用圆二色谱法检

3、测PEG修饰对KGF．1的空间结构的影响；采用NⅢ3T3细胞对修饰后产物的促增殖活性及激活MAPK／Erk通道活性的作用进行检测。在系统考察修饰蛋白热稳定、酶稳定性和pH稳定性基础上利用ELISA法分析了修饰蛋白在SD大鼠体内血药浓度变化的特征并测得了相应蛋白的体内半衰期；采取腹膜腔内注射四氯化碳的方法对修饰后蛋白的抗肝损伤作用进行考察。结果：优化影响蛋白药物聚乙二醇修饰的5个主要参数，得出对KGF．1蛋白进行PEG修饰的最佳条件：pH为6．5的20mM的PBS缓冲液，KGF一1与PEG的摩尔质量比为1：10，

4、KGF．1浓度为lmg／ml，25℃反应24h，PEG．丁醛和PEG．MAL最佳修饰条件基本相同，只是PEG—MAL的修饰过程中需要添加尿素才可得到较好的修饰效果。对修饰后产物的分离纯化，首先采用SepharoseG25柱上对蛋白样品脱盐，进而根据修饰前后蛋白对肝素结合力的差异采用肝素亲和层析方法分离纯化，结果显示该色谱方法分离效果好，修饰蛋白的纯度超过95％。MALDI—TOF．MS结果表明经过PEG一丁醛和PEG．MAL化学修饰后，PEG．KGF．1分子量分别为38．2kDa和37．6kDa，提示只有一个P

5、EG分子连接到KGF．1：N．末端测序结果显示野生型的KGF．1的N．端序列为Ser-Tyr-Asp．Tyr-Met，而修饰后PEG．KGF．1的N末端残基未被检测出来，表明PEG修饰为针对KGF．1蛋白N．末端的定点修饰反应。CD结果显示修饰前后4温州医学院硕士学位论文KGF一1远紫外吸收趋势相同，表明PEG修饰对KGF．1的二级结构基本无影响。修饰前后蛋白均能诱导NIH3T3细胞的有丝分裂，其中PEG．MAL修饰虽然获得的修饰率较高，但其活性只有野生型蛋白的17．3％，活性较差；PEG．丁醛．KGF．1相对

6、活性为89．6％，活性较好。另外修饰后蛋白可引发激烈的Erkl和Erk2磷酸化反应，表明PEG一丁醛单分子修饰KGF．1对KGF一1的增殖活性无显著影响。稳定性充分表明经过PEG．丁醛修饰后的蛋白热稳定性、抵抗酶降解能力以及抑制酸水解能力均有了显著的提高：另外，体内血药浓度检测结果进一步表明PEG．丁醛修饰显著延长了KGF．1体内半衰期(达到28h)，相比修饰前蛋白提高了将近8倍。抗肝损伤作用实验显示，PEG．KGF．1明显降低CCl4致大鼠肝损伤血清的川日、AST值，减轻CCl4对肝细胞的病理损伤，表明KGF

7、．1经修饰后具有良好的预防和治疗CCl4急性损伤的作用。结论：本实验基于一种重要的功能蛋白KGF．1稳定性差、体内半衰期短的缺陷提出了通过PEG定点修饰来改善KGF．1上述缺陷的新思路，本文重点考察了PEG．MAL和PEG．丁醛两种最常用的定点修饰制剂对KGF．1修饰的影响，通过比较分析，得出PEG．丁醛相比于PEG-MAL无论是修饰工艺还是修饰产物性能方面均具有明显的优势，在此基础上建立了PEG．丁醛修饰产物的纯化工艺，并研究和证实了PEG．丁醛修饰的KGF一1稳定性显著提高、体内半衰期显著延长，其对CCl4

8、引起的肝损伤保护作用也要显著优于修饰前蛋白，该研究为克服和解决KGF．1工业应用和临床推广过程中存在的缺陷提供了重要的理论依据和技术思路。关键词：角化细胞生长因子KGF．1，PEG定点修饰，分离纯化，稳定性，体内半衰期，抗肝损伤作用温州医学院硕士学位论文AbstractN—terminalSite—SpecificPEGyaltionofKGF1andThebiologicalacti