一步法复发及peg修饰及其修饰产物的性能研究

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1、万方数据论文答辩Et期：2Q!垒生§且!鱼旦万方数据温州医科大学硕士学位论文目录目录⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1缩略词表．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．．．7前言⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯9正文⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10第一章溶菌酶的同步复性与修饰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101、引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102、仪器与材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．113、实验方法⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．1溶菌酶标准曲线的建立⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．143．2溶菌酶的变性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯143．3溶菌酶同步复性与修饰⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143．4修饰产物的分离制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．153．5RP-HPLC对修饰产物进行浓度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．154、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．164．1溶茵酶的标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯164．2溶茵酶的变性⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．164．3溶菌酶同步复性与修饰⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．174．‘4修饰产物的分离制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯18万方数据温州医科大学硕士学位论文4．5RT-HPLC对其修饰产物进行浓度测定

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯205、讨论与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．215．1模型蛋白选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．215．2PEG修饰剂的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．215．3溶茵酶同步复性与修饰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21第二章同步复性修饰产物的结构与生物活性⋯⋯⋯⋯⋯．．241、引言⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242、仪器与材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243、实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．1同步复性修饰产物PEG—LYS分子量检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2同步复性修饰产物PEG-LYS．二-级结构检测⋯⋯⋯⋯⋯．．253．3PEG-LYS的活性研究⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．254、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．264．1MALD

5、-TOF_MS飞行质谱检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯264．2CD圆二色谱检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯274．3PEG-LYS的活性研究⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．275、讨论与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28第三章全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29参考文献．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．30附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．34综述及参考文献⋯．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．352万方数据温州医科大学硕士学位论文论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63万方数据温州医科大学硕士学位论文缩略词表4万方数据温州医科大学硕士学位论文一步法复性及PEG修饰及其修饰产物的性能研究中文摘要目标：建立一种新型的工艺路线，将蛋白复性与蛋白PEG修饰整合为一步，即同步复性与修饰，从而一步从包涵体蛋白得到高修饰率、高特异性、高纯度的PEG修饰蛋白，改善传统蛋白复性与PEG化学修饰步骤繁琐的缺陷。方法：配制不同浓度的溶菌酶(20mMPB，pH7．0)溶液，lip．HPLC测定各溶液的洗脱峰。以溶菌酶浓度为横坐标，洗脱峰面积为纵坐标，建立溶菌酶的标准曲线。精密称取25mg溶菌酶加入到2．5ml的蛋白变性液中(20mMPB，8M尿素，10

7、0mMDTT，pH7．0)使其终浓度为10mg／mL，室温放置4h待其变性。通过RP．HPLC确定其变性完全后用PD脱盐柱将溶菌酶中的DTT脱除；变性后的溶菌酶加入到含PEG的复性缓冲液中(4mMEDTA，lmMGSSG，10mMGSH，1．5Murea，pH6．0，30mMNaBH3CN)，分别在2、4、8、12和24h取样待测，取样后加入2％甘氨酸终止反应。通过12％SDS．P：AGE与RP．m，LC来摸索同步复性修饰的最佳反应条件并详细分析同步复性修饰的具体过程。我们对影响蛋白复性与液相PEG修饰反应的2个主要参数：即反应过程中缓冲液的pH值和反应时间进行了优化。IEC(离子交换

8、色谱)分析不同反应时间的同步复性与修饰产物，运用溶菌酶标准曲线与RP．HPLC分析同步复性与修饰过程中复性率和修饰率随时间的变化，反应结束后用无盐缓冲液将修饰蛋白混合液上样到预先平衡的离子交换色谱柱(IEC)，上样流速为0．5mL／min，上样结束后用无盐缓冲液冲下未与柱结合的杂质，然后分别用含0．2MNaCI与1．0MNaCl的缓冲液将未修饰的溶菌酶与修饰后的溶菌酶依次洗脱下来。运用MALDI．TOF质谱测定修饰产物的分子量；CD圆二色谱对比