碘化n-正丁基氟哌啶醇通过钙与非钙依赖机制抗心肌细胞缺氧复氧损伤的研究

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1、汕头大学硕士学位论文碘化N-正丁基氟哌啶醇通过钙与非钙依赖机制抗心肌细胞缺氧复氧损伤的研究硕士研究生：陈高勇导师：石刚刚教授专业：药理学研究方向：心血管药物的研究与开发申请学位：医学硕士入学时间：2009年9月中国.汕头2012.05N-n-ButylHaloperidolIodideProtectsCardiomyocytesagainstHypoxia/ReoxygenationInjurythroughCalciumDependentandIndependentMechanismsbyGao-YongChenSubmittedinpartialfulfillmen

2、toftherequirementsforthedegreeofMasterofMedicineThesisAdvisor:Prof.Gang-GangShiDepartmentofPharmacologySHANTOUUNIVERSITYMEDICALCOLLEGEMay,2012汕头大学硕士学位论文摘要碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butylhaloperidoliodide，F2）是我课题组研究合成的一种新型钙拮抗剂，其对心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤以及心肌细胞的缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,

3、H/R）损伤有良好的保护作用。前期研究表明，F2的保护机制还包括拮抗钙超载及抑制早期生长反应基因-1（earlygrowthresponsegene-1，Egr-1）mRNA和蛋白的表达。进一步研究显示，F2一方面能够通过抑制H/R所致的经典钙依赖型PKCα转位，进而抑制Egr-1过表达，保护心肌细胞；另一方面能够激活非钙依赖型PKCε转位，保护心肌细胞H/R损伤；另外，在L-型钙通道缺如的心脏微血管内皮细胞上，F2对H/R损伤依然有保护作用。这些研究结果提示，F2对心肌I/R损伤兼具有钙依赖和非依赖的双重保护机制。文献报道，作为丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-

4、activatedproteinkinases，MAPKs）中一个重要的亚族，细胞外信号调节激酶（extracellular-signalregulatedkinase,ERK1/2）对心肌I/R损伤具有重要的调节作用。因此，本研究以ERK1/2为切入点，首先观察了有钙及无钙条件下H/R心肌细胞中ERK1/2活性的变化；借助信号通路上特异性抑制剂或激动剂研究ERK1/2相关信号通路在H/R心肌细胞中的生物学功能；进一步探讨和明确F2保护心肌H/R损伤的钙依赖和非依赖的ERK1/2相关信号通路机制。方法：第一部分：钙依赖机制1．将原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为11

5、组：有钙对照（CaN）组、有钙缺氧/复氧（CaH/R）组、有钙H/R+F2（CaH/R+F2）组、有钙H/R+PKCα抑制剂Gö6976（CaH/R+Gö6976）组、有钙常氧+PKCα激动剂PMA（CaN+PMA）组、有钙H/R+F2+PMA（CaH/R+F2+PMA）组、有钙H/R+维拉帕米（CaH/R+Ver）组、有钙H/R+ERK1/2抑制剂U0126（CaH/R+U0126）组、有钙H/R+ERK1/2抑制剂PD98059（CaH/R+PD98059）组、有钙常氧+ERK1/2激动剂EGF（CaN+EGF）组和有钙H/R+F2+EGF（CaH/R+F2+EGF

6、）组。CaH/R组细胞换用被高纯氮气饱和30min的含钙缺氧液，置缺氧盒中37℃密闭培养2h，然后换用正常培养基于常规条件下培养细胞1h，建立H/R损伤模型；CaH/R+F2组、CaH/R+Gö6976组和CaH/R+Ver组于缺氧前30min、缺氧液及复氧培养基中分别给予F2I汕头大学硕士学位论文-6-6-6（1×10mol/L）、Gö6976（1×10mol/L）和Ver（2×10mol/L）；CaH/R+U0126组和-5CaH/R+PD98059组于缺氧前30min和缺氧液中分别给予U0126（2×10mol/L）和PD98059-5-7（2×10mol/L）；

7、CaH/R+F2+PMA组于缺氧前先给予F230min，接着给予PMA（1×10mol/L）10min，然后在缺氧液和复氧液中给予F2；CaH/R+F2+EGF组于缺氧前先给予F230min，接着给予EGF（50ng/ml）30min，然后在缺氧液和复氧培养基中同时给予F2及EGF；CaN+PMA组于培养基中加入PMA常氧培养10min，再换用新鲜培养基培养3h；CaN+EGF组于新鲜培养基中加入EGF持续培养3.5h；CaN组则于实验前换用新鲜培养基持续培养细胞3h。2．Western-blot方法检测心肌细胞磷酸化PKCα（p-PKC