碘化n-正丁基氟哌啶醇拮抗心肌细胞钙超载机制的研究

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1、博士学位论文碘化N-正丁基氟哌啶醇拮抗心肌细胞钙超载机制的研究博士研究生：黄勇攀导师：石刚刚教授专业：药理学研究方向：心血管药理学申请学位：医学博士入学时间：2009年9月二零一二年五月STUDYONMECHANISMOFANTAGONIZINGMYOCARDIALCALCIUMOVERLOADOFN-n-BYTULHALOPERIDOLIODIDEbyYong-PanHuangSubmittedinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofDoctorofMedicineThesisAdvisor:Prof.Gang-GangShiD

2、epartmentofPharmacologySHANTOUUNIVERSITYMEDICALCOLLEGEMay,2012汕头大学医学院博士学位论文摘要心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是心脏缺血性疾病和心脏外科手术后常见的一种病理生理现象，其机制可能与胞内钙超载、氧自由基释放、酸中毒等相关。在I/R过程中，L-型钙通道开放和钠钙交换体（sodium/calciumexchanger,NCX）被激活,导致细胞内钙增加。氧自由基过度释放激活细胞外信号调节激酶活化激酶（mitigen-activatedproteinkinasekinase,MEK）/细胞外

3、信号调节激酶(extracellularregulatedkinases，ERK1/2)/钠氢交换体(sodium/hydrogenexchanger,NHE)/NCX信号通路，也介导了I/R损伤。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butylhaloperidoliodide，F2）是本课题组在氟哌啶醇（haloperidol，Hal）的基础上改造得到的一个新化合物，前期研究发现，F2可以扩张冠脉血管和对抗I/R损伤，其心肌保护机制可能与其拮抗钙超载及抑制早期生长反应基因-1（earlygrowthresponsegene-1,Egr-1）基因与蛋白表达相关。本研究观察F2对缺氧复氧（hypo

4、xia/reoxygenation,H/R）模型、过氧化氢作用后心肌细胞L-型钙通道、NCX变化的影响；应用MEK、NHE特异性抑制剂或激动剂研究过氧化氢作用过程中MEK、NHE、NCX功能的变化及F2于其中的作用，进一步探讨和明确F2拮抗心肌细胞钙超载机制。方法：1．采用标准酶解法消化分离成年SD大鼠心室肌细胞。首先给予正常台式液灌流5min，然后给予充90%N2-10%CO2的缺氧液灌流若干分钟，灌流通过蠕动泵控制流速，最后给予正常台式液灌流，建立H/R模型。在正常台式液中加入过氧化氢，灌流若干分钟，建立过氧化氢模型。采用全细胞膜片钳技术观察F2对H/R模型及过氧化氢模型下L-型钙通道电

5、流和NCX电流的作用。2．Western-blot法检测过氧化氢作用后心肌细胞MEK、NHE、NCX的总蛋白表达及磷酸化水平。3．采用分离成年SD大鼠心室肌细胞。5µMBCECF-AM室温染色10min标记心肌细+胞内H，然后用台式液冲洗带走多余染料。细胞酸化模型的建立：用25mM氯化铵（NH4Cl）+处理无碳酸氢盐的克氏液孵育的心肌细胞3min，随后用无Na的克氏液将NH4Cl冲洗干4+净并孵育3min，此时细胞内的NH3快速扩散到细胞外，促使NH转化为NH3而导致细+++胞内H增加，细胞内酸化，再用含Na的克氏液替代无Na的克氏液，此时由于补充了+Na，细胞内酸化可以激活NHE而使细胞内

6、pH得以恢复。采用OlympusFluoViewFV1000I汕头大学医学院博士学位论文激光共聚焦显微镜记录图像。结果：1．H/R增加L-型钙通道开放频率及增加L-型钙电流，其增大率分别为15.89±3.22%。F2阻断H/R状态下异常开放的L-型钙通道，0.1µM、1µM、10µMF2对钙电流抑制率分别为44.35±5.52%、61.06±2.99%、71.88±4.45%。F2影响正常NCX电流，对外向电流的抑制率为39.51±2.62%，内向电流抑制率为10.68±0.62%(n=4)。H/R引起NCX电流增大，以NCX外向电流增加为主。F2可明显抑制H/R心肌NCX电流，并呈浓度依赖

7、，0.1µM、1µM、10µMF2对外向电流的抑制率分别为29.18±2.49%、53.38±5.01%、70.68±3.93%，对内向电流的抑制率分别为21.83±1.58%、38.56±5.52%、57.25±7.39%（n=9）（与模型组比较，P＜0.05）。2+2.过氧化氢增加L-型钙通道开放频率，L-型Ca电流增加，其增大率为33.65±1.90%。0.1µM、1µM、10µMF2对过氧化氢作用钙电