一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变检测

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分类号：R758．7密级：单位代码：10422学号：2009133370紊力孥硕士学位论文鼬绷咖愕踟加P胚砂Master’sThesis论文题目：一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变检测DETECTIoNoFGJB2GENEMUTATIoNINAFAMILYWITHVoHWINKELSYNDRoME合作导师：2012年5月16日 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：—型红日期：—出五以关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：巡导师签名：日 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··22结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··28参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··29论文综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··32致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··40攻读学位期间发表的学术论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·41 CONTENTSAbstmctinChinese⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·lAbstractinEnghsh⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3SymbolicdesCription⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5Preface⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6Materials锄dmemodS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10Results⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20Diseussion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·22Conclusion⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28Re诧fence⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29reⅣiew⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·32Acknowledgement⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨40“stofpublications⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41 山东大学硕上学位论文一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变研究研究生：王占想专业：皮肤病与性病学导师：张莉教授中文摘要研究背景残毁性掌跖角皮症(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)又称残毁性遗传性角质瘤(kerato腿hereditariamutilans)，于1929年由德国学者Vohwinkel首先描述并命名，因此该病又被称为沃温克耳综合症(Vohwinkelsyndrome，VS，oMIM124500)。它是一种罕见的常染色体显性遗传病，多呈家族性发病，同时也有散发病例的报道。该病好发于白种人女性，多于婴幼儿起病，病程呈进行性发展。其典型的临床表现包括：对称性弥漫性掌跖角化，掌跖表面呈蜂窝状小凹馅；手足背部及肘膝关节伸侧等可呈典型的海星状或条状角化过度斑块；远端指(趾)间关节呈环形缩窄并逐渐断离(假阿洪病样改变)。目前己定位克隆鉴定出两个与残毁性掌跖角化病有关的致病基因：分别是定位在13号染色体13q“q2上编码缝隙连接蛋白Cx26的GJB2基因和定位在1号染色体1q21上编码兜甲蛋白的LOR基因。由GJB2基因突变导致的残毁性掌跖角化病常伴有听力异常，被称为典型的残毁性掌跖角化病；由LoR基因突变导致的残毁性掌跖角化病常伴有鱼鳞病，又被称为变异型残毁性掌跖角化病。临床上我们收集到一残毁性掌跖角化病伴有感音神经性耳聋的家系，并对该家系进行了致病基因的研究。据我们所知，本研究为国内首次对该病进行致病基因突变检测。目的对一个中国汉族残毁性掌跖角化病家系进行致病基因突变检测，以明确其致病基因及突变类型，以期进一步明确临床表型与基因型的关系。方法收集该家系5例患者、12例正常人和100例健康正常对照外周血标本和家系患者临床资料。用外周血DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA，采用聚合酶链反应(PCR)扩增候选基因GJB2基因的整个编码序列和侧翼序列在内的1015bp， 山东大学硕士学位论文扩增产物纯化后应用ABIPR工SM3730XL自动测序仪直接双向测序，Sequencher4．10．1Demo软件与基因组序列进行比对分析，以明确具体的突变位置和突变方式。结果PcR产物测序结果显示：该家系所有患者GJB2基因均存在一个杂合错义突变196G—C，导致第一细胞外区域(E1)第66位天冬氨酸被组氨酸替代(即D66H)，而家系中12例正常人和100例非家系成员正常对照的DNA测序结果均未发现此突变。反向测序结果亦证实该突变。结论该家系所有患者均存在GJB2基因突变(D66H)，此基因为已知的残毁性掌跖角皮症致病基因，实验数据表明GJB2基因中D66H错义突变也是中国汉族人群中残毁性掌跖角化伴耳聋的致病原因之一，可以通过基因诊断和产前诊断阻止致病基因的传递。关键词Vohwinkel综合症；皮肤角化病，掌跖；基因GJB2；突变2 山东人学硕上学位论文DETECTIoNoFGJB2GENEMUTATIONINAFAMILYWITHVoHWINKELSYNDRoMEGraduates砌a11t：W撕gZhallXiaIlgsp鲥al：Dennat0109ya11dVherologyMelltor：ZhaIlgLiProfessorABSTRACTBackgroundVc}hwiIll(elsyIldrome’also1(Ilown髂MutilamingPalmopl锄tarKeratod∞n如isararcautosomaldomin锄tiIllleritodskindisease．npres即tswithseveralcutaIleousm锄ifestations，such勰dimsehyp酞eratosisofpahs觚dsol髂witllahoneycombappearance，st椭Sh—like蛔atosesandconstrictionbandsleadingt0a：uto锄putationoft11edi百ts(pseudoai妇)andismosnyr印ortedt0aSsociatedw洫tllemutationsinGJB2g铋e'wllich饥codescoIlIleXin26(Cx26)，aCompoIleIltof，intercellular卿junctionsandLORgme，whicheIlcodesloricrhl．WenowrepononaGJB2genemutimoninaC蛐1ese细nilyw弛VollwiIll【elsyndromeandsenS0rin吣ldea血essausori西nallydescmed．T0Ⅱlebestofourhowlcdge，t11isismefirstt0suggest廿1attheD66HmutationinGJB2geneisinV01VedintIlectiologyofC11inescVSwinldea缸essPcdi孕ee．objec咖eT0deteCtthe觚ltationofGJB2gencinaChinese缸nilywimvohwinkelsyndromeanddeamess．MethodsThepedi黟eemelll．bers’clillicaldataandbloodsampleswercc01lected筋m5a腩ctedpatielltsand4lnla腩ctcdindividualsindlc‰ily锄d1oohealⅡlyc0Il∞Dls．GenomicDNAw雒extractod舶mbloodsamples．Polymer嬲echainreaction(PCR)w嬲carricdoutt0锄pli矽me铋tireeIlcodingandflankingsequeIlceofGJB2gelleaIldfollowedbybidirectionalsequenCing．Finally’tllemutation锄alysis3 一．坐奎奎兰堡±兰垡笙奎_-__●-●_-●-_l-_-_-_-__-●_-______-●_-_-_●_-_●-●-I____--—___-_—__-————————————————一一一waSproc懿sedbySequ饥ch盯4．10．1D锄oso舳r缸e．ResultsAheterozygousIIlisseIlsemutation196G-+CinⅡ1eGJB2gene，wmchresultin廿1es1IbstitIltionofAspaIticAcidbyllistidineatcodon66(D66H)onme6rstt咖inalof廿1eprotein，w舔firldoutinallpatientoftllis鼬ily，butinnoneofⅡle4Ilo肌alindividualsiIlthis缸nily锄d1oohealtllycon的ls．ConclusionsAnD66Hmissense咖tationinnleCX26gcnecallalsocause、，rohwinkclsⅥldromewihdeamessinChineseHanpopulation．KeywordsVohwiIll【elsyndrome；GJB2gelle；DNAsequeIlciIlg；Mutation4 山东大学硕士学位论文‘渤ediseasegenomlcsHGPMDADARXRGenescanGenotypcrLillkageSTRHPICVSPPKEPPKPLSDPPSHEDPCROMIM符号说明基因病基因组学人类基因组计划单基因病常染色体显性遗传病常染色体隐性遗传病X连锁隐性遗传基因扫描基因分型连锁短串联重复序列杂合度多态信息量残毁性掌跖角皮症掌跖角皮症松解性掌跖角皮症掌跖角化伴牙周病综合症弥漫性掌跖角化病有汗性外胚叶发育不良多聚酶链反应人类孟德尔遗传在线5 山东入学硕士学位论文一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变研究．‘上--J一刖菁人类健康决定于人自身的遗传物质与其内外坏境因素相互作用的平衡，这种平衡可因遗传物质的变异或／和环境因素的作用而被打破引发疾病。人类的遗传物质——基因，几乎参与了所有人类疾病的发生，它包括易感基因和致病基因。因此，人类疾病在一定程度上也可被称为基因病(genedisease)。弄清遗传因素在各种疾病中所处的作用和地位不仅利于揭示疾病的发病机制、了解人体内外环境因素对人类健康的影响，而且将对疾病的诊断、治疗和预防等领域带来深刻的革命。因此，对人类各种疾病(即基因病)的致病基因或易感基因的定位、克隆及结构功能研究成为当下人类基因组学(genomics)研究的主流方向。随着20世纪，人类基因组计划(HGP)的完成，为21世纪基因诊断与基因治疗技术的发展奠定了坚实的基础。根据基因改变类型的不同，基因病可分为以下三种类型：单基因病、多基因病以及获得性基因病。单基因病(monogenicdiesase，MD)是由单个基因突变引起的一类遗传性疾病，也是唯一符合孟德尔遗传方式的疾病。】llD具有数量多，散发，危害子代健康的特点。在单基因遗传病中，遗传因素起了决定作用，通常呈现特征性的家系传递格局，而环境因素基本不起作用。其包括常染色体显性遗传病(autosomaldominantdisorder，AD)、常染色体隐性遗传病(autosomalrecessivedisorder，AR)、性连锁遗传病(sex一1inkeddisorder，XR)，性连锁遗传病又分为X连锁隐性遗传、X显性遗传、Y连锁遗传三类。迄今为止，己发现的单基因遗传病有一万多种，目前己分离得到了上千种重要的人类单基因遗传性疾病的致病基因。随着分子生物学及遗传学的发展，对单基因遗传性疾病的研究方法逐渐成熟，并形成了一套行之有效的研究方法体系，即通过大规模的全基因组扫描和分型连锁分析的方法对致病基因进行定位克隆研究。全基因组扫描(Genescan)所利用的是在人类基因组上大量存在的微卫星位6 山东大学硕十学位论文点，其原理是利用特定引物将某条染色体上特定位置的微卫星位点扩增出来，并进行分析。微卫星位点即DNA短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)，它广泛存在于人类基因组中，多位于内含子或非翻译区中，以2～6bp为单位，串联重复排列，其中以(CA)n为最多见。微卫星位点具有高度的多态性，高杂合度(heterozygosity，H)和多态信息量(polymorphisminformationcontent，PIC)，并以孟德尔共显性遗传。通过PCR方法，这些微卫星位点可以被运用于单基因、多基因遗传疾病的相关基因定位，精密遗传连锁作图，以及个体之间的鉴别、亲子鉴定等方面。微卫星位点的高度多态性和信息量，使该技术运用前景广阔。(1)作为遗传标记，构建遗传连锁图，为基因定位和基因组扫描提供帮助。(2)作为遗传标记进行遗传病的基因定位。当遗传标记与致病基因在同一条染色体上而且距离较近时，会阻止子代传递时的自由分离，出现连锁不平衡。因此可通过对遗传标记的检测，判断患者是否携带致病基因。(3)根据微卫星位点的个体之间的差别，设计以十几个微卫星位点为一组，以个体间的各位点基因型串联编码。可以用于判定两人间有无血缘关系，该技术在用于军事、法医等方面有着远大前景。临床上单基因遗传性疾病病大多为少见病或罕见病，单从医学的角度看，对该类疾病的分子机制研究似乎意义不大。实际上，对单基因遗传病的研究意义不仅限于阐明其发病机制，更重要的是：该类疾病相当于天然的基因剔除(功能丧失性突变)或转基因(获得性功能性突变)的模型，它为人们对重要基因的基因功能研究提供了一些不可多得的模型。通过对该类基因的功能研究，可以让我们认识它们所处的信号转导通路上的许多基因，进而认识这个基因相关的网络。这样，我们就可以寻找各种可能的环节来调控这些基因，为寻找药物的作用靶点提供线索与思路，为开发新药奠定基础。据文献统计分析皮肤科的单基因遗传性疾病大约有300余种，其中超过170多种单基因遗传性皮肤病已明确致病基因，已对近百种疾病的致病基因进行了基因定位‘"。掌跖角皮症(PalmoplantarKeratoderlllaPPK)又称掌跖角化病(keratosispalmarisetplantaris)，是以手掌和足跖皮肤增厚、角化过度为特点的一组慢性皮肤病口1。该病为一组临床表现复杂多变的遗传性或获得性皮肤疾病B3，遗传性掌跖角皮症大多为常染色体显性遗传性疾病，而且其致病基因大7 山东人学硕上学位论文多已被克隆鉴定出，如松解性掌跖角化病(EPPK)、Papillon—Lefevre综合症(PLS)、弥漫性掌跖角化病(DPPK)(又称Thost—Unna综合征)、残毁性掌跖角皮症(又称VohWinkel综合征VS)、条纹状角化病、Meleda病(MDM)(又名转移性掌跖角化病)、掌跖角化病伴发食管癌以及PPK合并耳聋等H嘲。遗传性掌跖角化病其遗传方式可为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传以及性连锁遗传等。常有家族史，同时也有散发病例的报道。也可以是其他皮肤病如银屑病、毛发红糠疹、痣样基底细胞癌综合症等或一些全身性疾病的表现(即症状性掌跖角皮症)。因临床表现、遗传方式及发病时间的不同，构成了许多不同的综合症。角皮症常以临床分类，诸如弥漫性、局限性、条纹状或点状等，但是这些类型之间并无绝对的界限，单一疾病的表现可以随着部位、年龄、性别或职业而变化。跖部皮损比掌部有更严重或更弥散的趋势。残毁性掌跖角皮症(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)又称残毁性遗传性角质瘤(keratomahereditaria舢tilans)，是掌跖角皮症中比较少见的一种单基因遗传性疾病。于1929年由德国学者Vohwinkel和Wigley分别对该病进行了描述并命名脯71，Vohwinkel所描述的患者为一名24岁白种人女性，其女儿也有类似病史。因此该病又被称为沃温克耳综合症(Vohwinkelsyndrome，VS，oMIM124500)。它是一种罕见的常染色体显性遗传病，好发于白种人女性，多于婴幼儿起病，病程呈进行性发展。典型临床表现包括：弥漫性掌跖角化过度，掌跖表面呈蜂窝状小凹陷；手足背部及肘膝伸侧等可呈典型的海星状或条状角化过度斑块；远端指(趾)关节呈环形缩窄并逐渐断离(呈假阿洪病样改变)砸’81。本病常伴有听力损失或鱼鳞病，前者又被称为典型的残毁性掌跖角皮症，后者被称为变异型残毁性掌跖角皮症。但也有同时伴有先天性耳聋和鱼鳞病的报道呻1。既往对本病的病因、分类及发病机制不太明确，近年来随着分子生物学和分子遗传学的发展，诸多学者对本病进行了相关基因即编码缝隙连接蛋白CX26的GJB2基因和编码兜甲蛋白的LOR基因的研究。Leen们等于1992年克隆了人类GJB2基因全长cDNA，并对该基因进行了功能研究。于1996年，Mignonn妇等克隆了该基因，并通过人一鼠体细胞原位杂交将该基因定位在人13qll—q12上。Hohln21等和Yonedatn31等先后克隆了人LoR基因全长cDNA和该基因，并将其定位在人1q2l上。1997年Kelselln町等对一同时患有遗传性掌跖角化病伴深度感音神经性耳聋8 山东人学硕上学位论文的家系进行致病基因检测时发现所有患者GJB2基因均发生了一个杂合错义突变101T—C，使Cx26N一末端区域第34位氨基酸，导致甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代，即M34T突变。1996年，Maestrini等n53收集到来自美国的一残毁性掌跖角化病伴有鱼鳞病的家系，通过连锁分析的方法将其致病基因定位在编码兜甲蛋白的LOR基因上，在对LOR基因进行序列分析时发现有1个碱基插入(730insG)，导致框移突变，改变了C末端富含甘氨酸一谷氨酸／赖氨酸的翻译结构，形成异常的兜甲蛋白，从而导致该病的发生。检索国内外文献至今共有6个国家的8个伴有鱼鳞病的残毁性掌跖角化病家系报道，共发现3种突变类型，分别是：730insG，662insT，709insCn纠力。其中730insG是最为多见的突变方式，在报道的8个家系中有6个是这种突变方式。1999年，Maestrini等n81对来自三个不同国家(英国、西班牙和意大利)的伴有感音神经性耳聋的残毁性掌跖角化病家系连锁分析及基因序列分析时发现，在所有患者的GJB2基因上均发现一错义突变，即第196位碱基G—C，致使第一细胞外区域第66位密码子有天冬氨酸被组氨酸替代，从而形成异常的缝隙连接蛋白26，出现异常角化表型。自此，在GJB2基因上相继共发现了四个突变位点与伴有耳聋的残毁性掌跖角化病有关，分别是p．Asp66His，p．Glyl30Val，pGly59Ser和Tyr65Hisn8吨¨。检索国内外文献，自1974年至2011年12月共有约60余篇相关报道，且大都为病例报告，对该病进行基因定位研究的仅有十几篇。国内文献有十余篇，均为病例报告，尚未见到国内对伴有听力异常的残毁性掌跖角皮症进行基因突变研究的报道。我们收集到山东某地的一残毁性掌跖角化病伴有感音神经性耳聋的家系，并对其进行了致病基因的研究。9 山东人学硕上学位论文1材料和方法1．1临床资料先证者，女性，20岁。因双手足、肘膝及臀部起红斑、丘疹及角化过度斑19年，伴听力下降3年就诊。患者自1岁左右时无明显原因于双侧掌跖部出现红斑、丘疹及黄色角化过度斑，无明显自觉症状，未予治疗。19年来，上述皮损逐渐加重，扩展至整个掌跖部皮肤，呈增厚的淡黄色角化斑块，表面为蜂窝状小凹陷。并累及手足背、指趾、肘膝伸侧及臀部等。近10年来，双手lO指关节僵硬，不能屈伸，不能抓握。近5年，远端指(趾)关节处出现环形缩窄，末端变细。近3年出现听力下降。曾经到过多家医院就诊，均未能明确诊断。自发病来，全身皮肤无干燥、脱屑；掌跖无恶臭及分泌物；视力无异常；生活基本可以自理。体格检查：先证者一般情况可，发育正常，身材偏小，智力正常，视力及眼底检查未见异常，心肺及肝肾检查未见明显异常。皮科所见：双手足掌跖部弥漫性淡黄色角化过度斑块，表面呈蜂窝状小凹陷，双手指屈曲，不能完全伸直，活动受限。(图1)；手足背部及指趾部可见海星状角化和条状角化增生，远端指(趾)关节可见纤维性缩窄环，未节变细；(图2)；肘膝伸侧及臀部可见条状及线状或斑点状肥厚性斑块(图3)；指(趾)甲变形、肥厚，呈嵴状拱起。其它部位皮肤粘膜未见异常。辅助检查：先证者血尿大便常规及肝肾功血生化检测未见明显异常；双手部X线检查示：骨质部分吸收或消失，病变尤以远端指骨最为明显，末端指骨变尖(图4)。先证者母亲双手X线检查显示：右手小指远端指骨已完全消失(5)。患者听力检查示：轻度感音神经性耳聋。家系调查：该家系4代32人中有5人发病，其中女4人，男1人，无隔代遗传现象，符合常染色体显性遗传(图6)。该家系所有患者均在1岁左右发病，症状相似(图7—9)，均表现为：掌跖弥漫性角化过度，表面呈蜂窝状小凹；肘膝及踝腕关节可见线状或海星状角化过度斑块；指趾末节出现纤维性缩窄环，并呈进行性指(趾)断症改变，症状进行性发展。所有患者均伴有不同程度的听力损失。均无鱼鳞病，智力、视力正常。家族中其他人情况良好，无其他遗传病史，无近亲婚配。lO 山东大学硕十学位论文根据典型的临床表现、辅助检查及家族性发病特点，本家系患者诊断为残毁性掌跖角皮症。先证者给予阿维A30mgqd口服治疗，并辅以中药活血化瘀，局部外用肝素钠及0．1％迪维霜。两周后皮损显著缓解，肥厚性角化斑开始松解脱落，治疗6周后皮损已明显好转，肥厚性的角化斑块基本完全脱落，露出红色新生皮面，手指缩窄环完全消失，指间关节活动状况显著改善，可以完全伸直(图10)。目前在治疗随访中。图l先证者：治疗前皮损，双手学部弥漫性淡黄色角化过度斑，表面可见蜂窝状凹陷，指指屈曲，不能完全伸直，手腕部皮损与正常皮肤边界清晰。图2先证者：皮损延至双手背部，治疗前皮损，可见条状或海星状角化过度斑块，指指关‘13．处可见纤维状收缩环，远：宵端变细。 山东大学硕十学位论文。———————————————————————————————————————————————————一图3先证者：臀部及膝部皮损，呈点状或条状角化过度性斑块。图4先证者双手x表现，掌跖骨质脱钙，远端指骨吸收，骨干萎缩。图5先证者母亲手部X线表现，右手小指远：肖端指骨缺失。12 山东大学硕士学位论文IIll¨IⅣ图6残毁性掌跖角皮症家系图，箭头所指为先证者，编号卜17为本研究对象。图7先证者外祖母双手皮损表现：十指基本完全断离。图8先证者外祖母双足跖部皮损表现：弥漫性匍过度，双小趾断离。—。’、-，4、√、， 山东大学硕士学位论文图9先证者母亲，右侧肘关节处典型的海星状角化过度斑块。图10先证者治疗6周后双手皮肤表现：肥厚性角化斑块已完全脱落，露出鲜红色的新生皮面，手指缩窄带已消失，手关节活动状况明显改善，可完全伸直。1．2主要试剂和仪器1．2．1试剂及其来源(1)EDTA抗凝齐0(2)冰乙酸(3)外周血基因组DNA提取试剂盒(4)蛋白酶K(5)异丙醇(6)70％乙醇(7)TAE缓冲液(8)TadDNA聚合酶天根生化科技(北京)有限公司Takara公司14 山东人学硕上学位论文(9)DNTPs(10)TadDNA聚合酶Buffer(11)引物合成(12)琼脂糖(13)DNA分子量标准1．2．2主要仪器设备及来源(1)电恒温水箱(2)涡旋混合器(3)台式高速离心机(4)MettlerAEloo电子天平(5)紫外分光光度仪(6)PCR扩增仪(7)DY—A电泳仪(8)UVP凝胶成像仪(9)自动测序仪Takara公司(含MgCl2)Takara公司生工生物工程(上海)有限公司．Takara公司北京长风仪器仪表公司通达科技公司上海医用分析仪器厂ANDHR一120型日本美国BioRad美国生物公司ABI2700上海康达电子仪器厂上海思伯明仪器设备有限公司ABIPRISⅥ3730XL1．2．3主要试剂的配方(1)(酸性)柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD)抗凝剂：称取柠檬酸钠1．329、柠檬酸O．489、葡萄糖1．479，加双蒸水至100ml，灭菌后备用。(2)TAE电泳缓冲液(50×浓贮存液)：精确称取2429Tris-base和100m10．5MdEDTA(pH8．O)，然后加入800ml双蒸水充分溶解。再加入57．1ml的冰乙酸，充分搅拌混匀。加双蒸水定溶至1000ml。(3)2％琼脂糖凝胶精确称取0．59琼脂糖，加入25m1lxTAE溶液，使用微波炉加热30s至充分溶解(防止暴沸)，等溶液温度降至大约60℃时加入2ul溴化乙锭，缓慢摇动烧杯使其混匀。将凝胶倒入已水平曹内(确保无水泡)，插入梳子，等其自然凝固后使用(至少要20min)。15 1．3主要使用软件(1)PremierPrimer5引物合成软件(2)Sequencher4．10．1Demo序列比对软件1．4实验方法技术路线图经知情同意后采集残毁性掌跖角皮症患者及其家系成员外周血标本正常人外周血标本loo份到GJB2基因的基因序列，序列的特异性引物PCR扩增包括整个编码序列及其侧翼序列在内的1015bp0PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后纯化测序，分析测序结果1．4．1患者家系及正常人外周血基因组DM的抽提使用天根生化科技(北京)有限公司生产的外周血基因组DNA提取试剂盒(目16缈擦船n妙捆几妙唰洲n妙O—O篡O姗馑慎自、『阱设CN．1=1、lI吲 山东大学硕上学位论文录号：DP319—01)提取患者家系及正常人外周血基因组DNA，试剂盒组成：细胞裂解液CL，缓冲液FG，缓冲液TB，蛋白酶K。表15m1外周血所需缓冲液用量如下(单位u1)血液细胞裂解液缓冲液FG蛋白酶K异丙醇70％乙醇缓冲液TB5000125002500252500500操作步骤如下：(1)裂解红细胞：将抗凝血5m1加入15ml离心管中，加入5m1细胞裂解液CL，上下颠倒混匀10次左右，4℃下8000rpm离心4分钟，倒弃上清；(2)再向其中加入7．5ml细胞裂解液CL，上下颠倒混匀10次左右，8000rpm离心4分钟，倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留3分钟，此时小心确保沉淀在管中；(3)吸取2．5ml缓冲液FG和25u1蛋白酶K预混；(4)向离心管中加入2．5m1蛋白酶K和缓冲液FG的混合溶液，立即涡旋混匀至溶液无团块；(5)将离心管放入65℃水浴30分钟，期间颠倒混匀数次。此时可见到溶液的颜色从红色变为黄绿色，表示蛋白成分在发生变性；(6)再向离心管中加入2．5ml异丙醇，上下颠倒20次以上，以充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。4℃下8000rpm离心10分钟，倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，此时小心确保沉淀在管中；(7)加入2．5m170％乙醇，涡旋震荡5秒钟，4℃下8000rpm离心4分钟，倒弃上清。重复该步骤1次；(8)将离心管倒置在于净的吸水纸上停留10分钟，确保沉淀在管中。空气干燥DNA沉淀，直至所有液体挥发干净。乙醇残留回影响后续的PCR反应，同时应避免过分干燥DNA沉淀，因为过于干燥的DNA很难溶解；(9)向离心管中加入500ul缓冲液TB，低速涡旋5秒钟，放入65℃水浴加热1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶；(10)测定DNA浓度的：吸取DNA原液1肛l，用紫外分光光度仪检测260nm和280nm的吸光度，计算oD值和DNA原液浓度；(“)稀释DNA：按已测的DNA原液浓度，把所有样本的基因组DNA稀释成50ng／肛l17 山东大学硕十学位论文的浓度，一20度保存，以备下后续PCR反应使用。1．4．2PCR引物设计原则．PCR扩增特异性和扩增效率两者间相反相成，引物设计的目的是在扩增特异性和扩增效率两者间取得平衡，其部分基本原理如下：(1)引物长度：一般为15—30bp，常为20bp左右，最长应不大于38bp。引物长度是决定退火温度(Tm值)的最重要因素，以下公式可以粗略计算引物的Tm值：当引物长度小于20bp时，Tm值=[4(G+C)+2(A+T)卜5℃；当引物长度大于20bp时，Tm值=62．3℃+0．4l℃(％G—C)一500／length一5℃。使用确保Tm值不低于54℃的最短的引物可获得最好的扩增效率和扩增特异性，从而优化PCR反应。(2)引物中的GC含量：引物中G+C含量以40一60％为宜，含量太少扩增效果不佳，过多易出现非特异条带。引物中四种碱基最好随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列，否则容易导致错配。(3)Tm值：退火温度需要比解链温度大约低5℃左右，如果引物较短，可以适当提高Tm值，这样可以使PCR扩增的特异性增加；如果引物较长，那么可以适当降低Tm值，使DNA双链结合。一对引物的Tm值相差5℃左右一般不会影响PCR的产率，理想情况下引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。(4)避免两条引物间互补，尤其是3’末端的互补，否则会形成引物二聚体，从而产生非特异的扩增条带，同时应避免引物内部出现二级结构。(5)△G值：指DNA双链形成时所需的自由能，它反映了DNA双链结构其内部碱基对的相对稳定性。应该选用3’末端△G值较低(绝对值不应超过9)，而5’末端和中间位置△G值相对较高的引物。引物3’末端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构从而引发DNA的聚合反应。总之，引物设计有至少要遵循3条基本原则：(1)引物与模板的序列紧密互补；(2)引物与引物之间避免不能形成二聚体或发夹结构；(3)引物不能在非目的位点发生DNA的聚合反应(即错配)。1．4．3PCR(聚合酶链反应)扩增(1)模板：患者家系及正常人外周血基因组DNA(50ng／p1)。(2)扩增候选基因：通过美国国家生物信息中心(nationalcenterfor 山东大学硕士学位论文biotechnologyinfo瑚ation，NCBI)的基因库检索到GJB2基因序列，GJB2基因共有2个外显子，氨基酸编码序列仅在第2个外显子上，编码区有68lbp，编码226个氨基酸。严格按照引物设计原则，应用PremierPrimer5软件设计引物扩增包括整个编码序列及侧翼序列的1015bp，其上游引物57—-ACCTGTTTTGGTGAGGTTGTG一37；]：游弓I物57一CCATTGTGGCATCTGGAGTT一37，由-J己海生工生物工程技术服务有限公司合成。(3)PCR反应体系表225ul反应体系反应物反应体积(u1)TaKaRaTaqHS(5U／u1)10×PCRBuffer(M92+plus)dNTPMixture(各2．5mM)ForwardPrimer(10uM)ReversePrimer(10uM)基因组DNA(50ng／p1)ddH。O0．152．52．O0．51．O18．35总体积25．0(4)PCR反应条件stepl：94℃预变性5分钟step2：94℃变性30秒step3：58℃退火30秒step4：72℃延伸30秒step5：gotostep2，35cyclesstep6：72℃延伸7分钟step7：4℃foreverstep8：endPCR反应在(美国生物公司ABI2700)热循环仪上完成1．4．4嬲琼脂糖凝胶电泳检测PcR扩增产物19 山东火学硕}?学位论文取2ulPCR扩增产物，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测分析。电泳缓冲液：1xTAE电泳条件：电压120v，时I、白J25分钟UVP凝胶成像仪下观察并记录结果。1．4．5PCR扩增产物直接双向测序分析将所有患者及『F常人PCR扩增产物送至北京华大基因研究中心纯化后直接双向测定DNA序列，测序引物为PCR扩增时的正反双向引物，所用仪器为ABIPRISM3730XLDNA自动测序仪。1．4．6测序结果比对分析使用Sequencher4．10．1Demo软件将测序结果与基因数据库中公布的基因组标准序列进行比对分析，查找有无突变，并进一步明确具体突变位点和突变方式，从而判断氨基酸编码序列的改变。1．4．7突变位点的证实(1)将患者目的片段PCR扩增产物进行正反双向测序，明确突变位点。(2)随机抽取100位健康正常人的外周血标本，使用DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA，PCR扩增GJB2基因突变位点附近的基因组序列，扩增产物纯化后用ABIPRISM3730XL自动测序仪测序，并进行序列比对分析。2结果2．1PCR扩增产物用同1对引物逐一扩增残毁性掌跖角皮症患者家系成员及健康正常人GJB2基因全部编码区外显子序列和部分侧翼内含子序列，均得到预期长度的DNA目的片断。(图11)图11PCR产物的电泳图像：卜5为残毁性掌跖角皮症家系中患者，6—7为家系中正常人。20 山东大学硕士学位论文2．2DNA双向测序结果将所有患者及正常人测序结果利用Sequencher4．10．1Demo软件与基因库公布的GJB2基因序列进行比对分析发现：该家系所有患者GJB2基因均存在一个杂合错义突变196G—C(图12)，导致第一细胞外区域第66位天冬氨酸被组氨酸替代(即D66H突变)，而家系中12例健康正常人及100例非本家系成员健康正常对照的DNA测序结果均未发现此突变，从而证明D66H突变不是多态性。GTGTGcTACGATC^CTACTC(a)健康正常对照的GJB2基因正向测序结果(对应63—69位密码子)。cTG-rCC?rACc^TC^CTACTC(b)所有患者GJB2基因正向测序显示：196G—C杂合突变，导致第一细胞外区域第66位天冬氨酸被组氨酸替代(即D66H突变)。(c)健康正常对照GJB2基因反向测序结果。2l 山东大学硕士学位论文GT▲eTG^T■■tGT^GC^c(d)所有患者GJB2基因反向测序结果显示：196C—G杂合突变，同样证实D66H突变。图12残毁性掌跖角皮症患者及健康正常对照的GJl32基因正反双向测序结果3讨论现代分子遗传学认为，基因是DNA分子上具有遗传效应的核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA片段。在染色体上基因呈线性排列，不仅通过复制可向下一代传递信息，使子代与亲代表现出相似的性状，还可使遗传信息得到表达，以一定的方式反映到蛋白质分子结构上。基因检测是通过探测基因的存在，分析基因的缺陷及表达功能是否正常，从而对疾病做出诊断，为后续的早期干预、早期治疗及遗传咨询做准备。几乎所有人类疾病都与遗传因素(即基因)有关系，在遗传因素与环境因素相互作用下导致疾病的发生。因此大多人类疾病又可以被称为基因病，基因病在临床上可分为以下三类：单机因病、多基因病和获得性基因病。单基因病的研究方法主要是：在全基因组扫描之后进一步做基因定位研究，动态图变、同胞对法、连锁和连锁不平衡分析法及候选基因法，其中最常用的是连锁分析的方法。全基因组扫描的方法可以确定是否有基因突变，能够提供突变基因所在区域的信息，但是该方法不能确定突变的类型及其精确的突变位置。随后的DNA测序分析变可明确突变类型及准确的突变位置，从而明确疾病的致病基因。临床上我们收集到一残毁性掌跖角化病(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)伴有感音神经性耳聋家系，该家系在遗传方式上有以下特点：1．患者双亲之一是患者；2．同胞中患者的比例大约为二分之一；3．连续传递，无隔代遗传现象，符合常染色体显性遗传的特点。临床表现有如下特点：所有患者均在1～2岁左右开始掌跖部位出现红斑、丘疹和淡黄色角化过度性增生，此时身体其它部位皮肤未见角化过度性皮损，上述症状逐渐加重，掌跖部出现弥漫性角22 山东大学硕士学位论文化过度斑块，表面可呈典型的蜂窝状小凹，致使患者双手指指屈曲，不能完全伸直，活动受限。皮损呈进行性发展，逐渐向指(趾)部及手足背部蔓延，边界清晰，同时皮损可延至肘膝部、臀部等。手足背部、肘膝关节及踝关节等处可见典型的海星状角化过度斑块。指甲变形、肥厚，呈嵴状拱起。该家系中所有患者均在10岁左右开始指(趾)关节处出现纤维性收缩环，尤以远节端较重，并逐渐出现指(趾)断离(即假阿洪病样改变)。家系患者中均伴有感音神经性耳聋，随着年龄的增大，耳聋程度逐渐加重。所有患者均未伴有鱼鳞病，毛发、牙齿及出汗均无异常，智力及视力正常，可与综合症型掌跖角化病如：Pap011in—Lefevre综合征(PLS)、有汗性外胚叶发育不良(hidroticectodermaldysplasis，HED)等鉴别口2’231。与国内大多数文献报道不同的是，本家系患者皮损中均无糜烂、渗出及恶臭味分泌物等随棚3。该病在发病初期尚未出现环形缩窄时，需要与其它遗传性掌跖角化病相鉴别。以上几种综合症型遗传性掌跖角化病症状相互重叠，有时单从临床不易区分，因此可以通过基因检测以明确临床诊断。自1929年，Vohwinkel首次对本病描述并命名以来国内外共有60余篇对本病的报道，该病多于婴幼儿起病，好发于白种人女性，参考文献多呈家族性发病，为常染色体显性遗传，同时也有散发病例报道渊。本病主要皮肤表现有：①掌跖角化：在婴幼儿期，首先于掌跖部出现红斑或斑块状角化过度，并进行性发展，呈弥漫性分布，表面呈蜂窝状小凹，并向手足背、腋窝、踝、肘、膝及足底等处扩展。肘膝及踝等关节处呈特殊的海星状或条状角化过度斑。②假阿洪病样改变：发病约4—5年后，患者指(趾)远端关节处发生纤维性收缩窄带，并呈进行性指(趾)断症改变，(约10余年)，以小指(趾)最多见，最终可有几个指(趾)被累及，且出现环形缩窄的时间似乎与掌趾角化的程度无关。③合并症：患者掌趾皮肤常因高度角质增生、多汗或指(趾)部缩窄而诱发皲裂、浸渍或感染，并导致疼痛和活动障碍。X线检查：掌指骨质脱钙，有营养性股萎缩，远端指(趾)股吸收，骨干缩窄。组织病理：表皮角化过度、角化不全，颗粒层曾厚，棘层肥厚，表皮突延长，真皮血管周围可见少量炎细胞浸润。本病可以同时伴有其它皮肤表现：①甲改变：指(趾)甲可有嵴状拱起、残缺不全、甲弯曲及甲营养不良。②在一些受累个体可以见到弥漫性广泛性鱼鳞病样皮肤病，由于兜甲蛋白突变而听力正常的类型是特异的。③听力异常：高频性 山东大学硕士学位论文耳聋、听觉丧失、聋哑，本病经常伴随轻微至中等感觉神经性听力丧失。④头发生长异常：瘢痕性秃发、⑤口周脂溢性鳞屑、表皮松解性角化过度、白癜风、癫痫、暗红色角化斑及腋窝浸渍性白斑等，还能合并癫痫、性功能减退及脊髓空洞症等‘拍’2钉。如果残毁性掌跖角皮症合并腔口部位皮肤黏膜的角化，则称为0lmstedSyndrome。它也属于常染色体显性遗传的弥漫性掌跖角皮症，可伴有关节松弛和脱发，多见于男性，在腔口周围(尤其是口周和肛周)及臀部可见到对称的、黄褐色角化过度性斑块和丘疹。其它临床表现可伴有关节松弛、弥漫性脱发、甲营养不良及口腔黏膜白斑等啪1。目前本病分型尚不明确，根据伴随症状将其分为两种：(1)伴听力损伤的为经典型；(2)伴鱼鳞病者为变异型，后者一般没有海星状角化损害。但最近也有报道两者均伴有或者均不伴有的病例。因此其临床分型尚待进一步研究。随着分子遗传学的发展，可按考虑照突变类型进行分类。至今该病没有统一诊断标准，总结本病特点及参阅文献报道船罔瑚1认为其诊断通常依据以下5点：(1)幼儿期发病，女性多见；(2)弥漫性掌跖角化过度，表面呈蜂窝状小凹；(3)手足背的皮损呈特殊的海星状角化或线状角化，可延之肘、膝、等处：(4)假阿洪病样改变，常先从小指(趾)发生纤维性收缩带，并呈进行性指(趾)断症改变；(5)X线检查：掌趾骨质脱钙，有营养性骨萎缩，远端指(趾)骨吸收，骨干萎缩。此外，不同病例尚可伴有不同的相关症状，如不同程度的鱼鳞病、耳聋等。到目前为止，共发现两个与残毁性掌跖角皮症相关的致病基因，一个是编码连接蛋白26的GJB2基因，定位于13q11—12上；另一个是编码兜甲蛋白的LOR基因，定位于1q21。临床表型上前者常伴有听力损害，与1929年Vohwinkel首次对本病的描述相同，因此伴听力异常的残毁性掌跖角皮症又被称为经典型残毁性掌跖角皮症；后者常伴有先天性鱼鳞病，不同于前者，此类型听力无异常，被称为变异型残毁性掌跖角皮症。GJB2基因在1992年被克隆出并定位于染色体13q11一q12上，该基因全长4804bp，编码区为678bp，含2个外显子，但编码区仅位于下游外显子上，编码含有226个氨基酸缝隙连接蛋白26(Cx26)，因此很容易通过PCR扩增并测序分析。 山东大学硕士学位论文1997年人们发现GJB2基因与遗传性非综合征性耳聋(NSHI)关系密切相关，而且经研究发现235delC是该病最常见的突变类型。经免疫组化证实，在声音传导过程中内耳非感觉上皮细胞和组织细胞表达的Cx26蛋白，对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调控作用。GJB2基因突变后导致K+进入内淋巴液受阻，从而导致感音神经性耳聋。随后研究发现大约一半以上的遗传性非综合症性耳聋患者是由GJB2基因突变所致，因此该基因已作为先天性耳聋患者的常规筛查基因。Cx26是缝隙连接大家族中的一员，属于§一2型缝隙连接蛋白。缝隙连接存在于几乎所有类型的细胞表面，为电突触的结构基础，它是相邻细胞膜间信细传递的通道，只允许细胞间离子及小于lKD的代谢小分子物质通过。当细胞接受刺激后，细胞膜内外电势改变，缝隙连接通道开放，将离子及其它调节物质(如第二信使)传递给相邻细胞，使之产生相应反应。每个缝隙连接由相邻细胞间包膜上的连接子(connexon)锚定形成，每个连接子又有六个相同或不同的缝隙连接蛋白组成，它可以调节通道的开闭，从而选择性让小分子物质通过。缝隙连接蛋白(connexin，Cx)是缝隙连接的物质结构基础，参与细胞间信息传递、物质运输及生长调控等，据文献报道，它与肿瘤的发生关系密切。迄今为止，在缝隙连接蛋白大家族中至少发现了20多个成员，分子量均在26～56KD之间，分为Q～Cx和B_Cx。连接蛋白有着共同的结构基础：四次跨莫将其分为五个区，即N端、C端区，跨膜区(TM卜4)，细胞外区(E1和E2)，细胞内区(CL)。N端与TMl之间的胞内区构成电压感受器的电荷复合体，E1与E2区决定连接蛋白之间的相容性，CL和C端区与间隙连接通道的PH门控有关。连接蛋白基因突变可产生无功能或功能缺陷的连接蛋自，使缝隙连接缺损，通道开闭异常，从而导致细胞间信息传递受阻或紊乱。1999年，Maestrini等n胡对三个来自不同国家(英国、西班牙和意大利)的残毁性掌跖角化病伴感音神经性耳聋家系进行研究时，通过连锁分析首次将本病的致病基因定位在13号染色体q11一q12上，在对GJB2基因进行基因序列分析时发现，在三个毫无关系的家系中所有患者的GJB2基因均存在一个杂合错义突变196G—C，导致第一细胞外区域第66位天冬氨酸被组氨酸替代(即D66H突变)，而家系中所有正常人的GJB2基因测序结果均未发现此突变。此结果说明D66H 山东人学硕士学位论文是残毁性掌趾角皮症伴感音神经性耳聋的致病基因，导致Cx26分子的第1个细胞外区的1个高度保守的残基发生改变，进而干扰连接小体的组装，以及Cx分子锚定于邻近细胞和在缝隙连接中所起的门控功能。进一步研究表明所有患者均为携带该突变基因的杂合子个体，由此作者证实该突变为常染色体显性遗传性聋的病因之一。2005年，RikkertL．Snoeckx等n们在分析埃及耳聋患者中GJB2基因突变时，其中有一个伴有Vohwinkel综合症的家系，患者为父子两人，均有弥漫性掌跖角化伴深度感音神经性耳聋，父亲右足的第2，3趾有纤维性缩窄环，即假一阿洪病样表现。在对该家系进行GJB2基因序列分析时发现一个新的突变位点p．G1y130Val(G130V)，此点是位于GJB2基因高保守区域的一个显性突变。该家系正常人中未发现此突变。据说GJB2基因的显性突变导致听力异常和皮肤病可有不同程度外显率口¨，所以该家系中儿子未有典型的假阿洪病样表现。在VS致病基因中，G130V是唯一位于GJB2基因的第二细胞外区域的突变位点。2006年，Marie—LouiseBondeson等嘲对瑞典一VS患者做GJB2基因突变检测时发现另一个新的突变位点p．Gly59Ser(G59S)，患者为一60岁的老年男性，掌跖弥漫性角化过度增生，呈蜂窝状小凹，指趾可见假阿洪病样改变，同时伴有先天性聋哑和泛发全身的鱼鳞病。突变点位于GJB2基因的第一个高度保守序列的非保守突变。该患者父母早逝，无子女，G59S为一新发突变，并最终发展为基底细胞癌和鳞状细胞癌。该患者患有典型的残毁性掌跖角皮症症状，但同时伴有先天性耳聋与鱼鳞病，因此GJB2基因上G59S突变是如何导致本病还需要进一步研究。2011年，deZwart—Sto瑚乜¨等，发现了第四个引起残毁性掌趾角皮病的突变位点，p．Tyr65His(Y65H)，该位点与99年Maestrini等发现的突变位点(D66H)紧紧相邻，相邻的两个密码子突变引起相同的临床表型，这在GJB2基因上还是第一次见到。同时该学者通过研究发现：Y65H突变形成的变异型Cx26D蛋白的结构及在细胞中的分布异常，且有缝隙连接蛋白26形成的缝隙连接对燃料的转移较野生型Cx26明显减少。至今，在GJB2基因上共发现以上4种突变类型与典型残毁性掌跖角皮症有关，均为单一碱基杂合错义突变，说明部分氨基酸残基在该病的发生发展中起着 山东大学硕上学位论文重要的作用。有研究报道，D66H和Y65H突变形成的突变型Cx26在细胞中分布和结构异常，导致其形成的缝隙连接通道功能障碍，采用细胞荧光免疫示踪法(parachuteassay)检测到由突变型Cx26构成的连接通道对染料的转移较野生型Cx26明显减少n8_k3¨。LOR基因编码兜甲蛋白，于1992年，Yonedatn∞等通过原位杂交将该基因定位在1q2l上，mRNA全长1197bp，编码316个氨基酸。兜甲蛋白是构成角质化细胞膜的主要蛋白，一种富含甘氨酸的碱性蛋白质，位于表皮颗粒层的浅部，通过转基因鼠的功能分析发现突变的异种兜甲蛋白在颗粒细胞核内蓄积进而影响随后的表皮分化而导致皮肤病的发生。伴有鱼鳞病的残毁性掌跖角皮症较伴有听力异常的更为少见，至今，国内外共发现8个患该病的家系，3种突变类型，分别是：730insG，662insT和709insCn¨"，均为单一碱基插入突变。8个家系中有6个家系的突变方式为730insG，可见在LOR基因上730insG是导致该病的热点突变。730insG突变导致移码突变和异常的C末端，改变了C末端84个氨基酸并且比野生型兜甲蛋白增加了22个氨基酸，致使富含谷氨酸／赖氨酸的序列改变为富含精氨酸／亮氨酸序列，此结果同样出现在4个不同的国家(英国、日本、苏格兰、德国)中，说明在不同的种群中存在相同的突变热点。在仅有耳聋的vS家系中未发现该突变，说明此突变仅存在于伴鱼鳞病的VS家系中。本病为残毁性的，并可引起疼痛等其它不舒服的症状，严重影响了患者的身心健康，早期干预可以获得较好的近期疗效，因此，对可疑患者应早诊断，早治疗。由于本病较为罕见，对其治疗的报道更为少见，缺乏长期的临床观察。总结历年来的文献报道，本病治疗后近期疗效较好，远期预后不明确，而且只是对症治疗，局部的角质剥脱剂和系统应用阿维a酯、异维A酸等治疗角化过度的首选，口服维A酸类卜2个月可见角化过度及纤维环明显缓解㈨。但是长期应用维A酸类所引起的一些副作用也不得不重视，如对骨骼的毒性限制了阿维a酯的使用。外科重建治疗假阿洪病样损害：手术治疗主要针对指(趾)的环形缩窄及假阿洪病样损害，手术方法主要包括：收缩带的松解和z字成行术、皮肤移植术，晚期施行截肢术∞朋1。到目前仅有5例文献报道是关于外科治疗的，前三例报道是应用上述外科矫 山东大学硕士学位论文治的方法治疗后都有很高的再发率和远期疗效不满意。2009年，SinhaM侧等报道了两例外科治疗后并分别随访5年和8年，预后较前改善。用于缓解挛缩皮肤的全皮移植手术的远期移植瓣易变得肿胀，引起局部疼痛而不得不多次外科修复，外科矫治很容易做到，但是很难保持，常得不到满意的疗效。因此他们认为：外科治疗应注重神经血管的修复。2010年，BassettoFm3等对另一患者左手第五指的环形缩窄应用邻指皮瓣治疗，随访18个月，效果满意。我国学者蒋建华报道一例，应用大剂量丹参滴注以改善末梢微循环，内服维生素AD和角质剥脱剂维胺酯胶囊，局部用尿素软膏和水杨酸软膏封包，治疗2个月，症状明显改善口副。综上所述，本病的治疗上尚没有特效方法，应根据患者的具体情况尽早综合治疗，尽可能减少副作用的发生，提高患者生存质量。外科手术尚有待进一步研究。本研究中致病基因的确定可用于产前诊断，阻止其在该家系中传递，从而优化家系成员，减轻社会负担。虽然现在众多学者已对该病做了大量的研究，但目前残毁性掌跖角皮症的致病基因及发病机制仍不十分清楚，依旧处于探索阶段，由于该病比较罕见，在积极总结前人研究成果的基础上，我们要继续收集患者家系，并对其进行基因检测，丰富遗传资源。另一方面从基因功能研究上探索该病的发病机制，为今后对该病的诊断及治疗打下坚实的理论基础。4结论(1)GJB2基因中D66H错义突变为本家系的致病基因。(2)在GJB2基因中D66H错义突变是中国汉族人群中典型残毁性掌跖角皮症的致病原因之一。 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山东人学硕上学位论文andFunc虹onofanewcl弱sof印ide咖alcellenVelopep∞teiIlS．[J】．Bi01．Ch锄，1991；266：6626．6636．【13】YonedatKHolllD，McBrideO，eta1．neh【maIlloricmgeIle忉．Bi01．Chem，1992；267：18060-18066．[14】KelsellDP，DuIlIopJ，StevellsHP，eta1．C0衄e洳26mutationsiIlh删itarynon-sylldromicsellso血euraldea舭ss[J】．Nature1997；387：80—83．[15】MaestrilliE，MonacoAP，McGramJA，eta1．Amotcculardef；烈iIllori嘶n，mem旬orcompon％t“t王leconli矗ed捌lenVelope，ulld鲥iesVoh州lll(el’ss)，Ildrome．NatllrcGenetl996；13：70-77．【16】心ms乜-ongDKB，McKerulaKE，Hu曲esAE．AnoVcIinsertionalmutationinlori嘶ninVohwiIll【el’skeratodenlla．JhlvestD锄latol，1998；111：702—704．【17】Ishida-Y抽锄ot0A，McGr砒J八L锄H，eta1．Themolecularpathologyofprog声essiVesyInmetric戗yⅡl：rokeratod蹦na：af．rameshiftmmationiIltheloricriIlg搿leandpe咖rbatiollsinnlecomifiedcellellvelope．AmJHunGellct，l997，6l：58l一589．[18】MaestriIliE，KorgeBP，0c碰a-Sie盯aJ，eta1．AmisseIlsemutationinco皿exiIl26，D66H，causesmutilatingkeratode衄awimse芏180fineur2Lldea伍essmhwinkeI’ss)，lldrome)int11reelmreIatedfamilics．H哪MoIGenet，1999，8(7)：1237—1243．【19】Snoecl()【RL，Hass锄DM，＆曲棚NM，吼a1．Mutationa11alysisofnleGJB2(C0衄eXin26)geneiIlEgypt．H啪Mutat，2005，26(1)：60·61．【20】BondesonML，Ny咖啪AM，GullIlarSsonU，eta1．Collll懿in26(GJB2)mutationsin铆oSwedishpatientswimatypical、bhwiI呔cl(舢tilatingkeratod黜1aplusde疵ess)andⅪDsyn抓’mebomext铋SiVely垃eatedwit圭lacitretin．ActaDe蕊Vmerc01，2006；86(6)：503—508．【21】deZwan—Sto珊EA，V觚GeelM，veySeyE，eta1．AnovelmissensenmtationinGJB2，p．1'yr65His，causesscvere、7．ohwinkelsyndrome．BrJDefmat01，20ll，164(1)：197一199．[22】GorlinRJ，Sed撇0H，AndcrsonⅦ．Thes弘1dromeofpalm唧l觚tarlIyperkeratosis锄dprema：tureperiodontaldestmctionofmetee吐1．Aelimcal锄dgeIletic锄alysisofmePapillon．LefeⅥesyndrome．JPedia饥1964，65：895—908．[23】B撕sHN，Zlotogorsl(iA，Peretz-Amitqeta1．An0VelGJB6missense30 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山东大学硕士学位论文论文综述残毁性掌跖角皮症致病基因的相关研究进展【摘要】残毁性掌跖角皮症(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)是一种非常少见的常染色体显性遗传性疾病。目前很多学者虽已对该病进行了大量研究，但其发病机制仍未明确。据文献报道，已发现两个与该病有关的致病基因，一为编码缝隙连接蛋白的GJB2基因，另一个是编码兜甲蛋白的oLOR基因，包含GJB2基因和LoR基因突变的转基因鼠模型己复制成功，为该病发病机制的探讨提供依据。本文对该病致病基因的相关研究进展进行了综述。【关键词】残毁性掌跖角皮症GJB2基因LOR基因【正文】1残毁性掌跖角化病残毁性掌跖角化病(MutilantingPalmoplantarKeratoderlIla)又被称为沃温克耳综合症(Vohwinkelsyndrome，VS，0MIM124500)。于1929年由德国学者VohwinkelⅢ和Wi91ey跚分别独立描述并命名，它是一种罕见的常染色体显性遗．传病，多呈家族性发病，同时也有散发病例的报道。该病好发于白种人女性，多于婴幼儿起病，病程呈进行性发展。其典型的临床表现包括：对称性弥漫性掌跖角化，掌跖表面呈蜂窝状小凹馅；手足背部及肘膝关节等处可呈典型的海星状或条状角化过度斑块；指趾远端环形缩窄并逐渐断离(呈假阿洪病样改变)。X线检查可见：掌趾、跖趾骨质脱钙，远端指(趾)骨吸收，营养性的骨萎缩。皮肤病理改变：表皮高度角化过度，颗粒层与棘层增厚。真皮浅层血管周围可见炎细胞浸润。临床可伴有不同程度的感音神经性耳聋，先天性鱼鳞病，秃发，白癜风，癫痫等口，钔。如果残毁性掌跖角皮症合并腔口部位的角化过度性增生，则被称为01mstedSyndrome啼3。该病也属于常染色体显性遗传性疾病，可伴发脱发及关节异常。本病呈慢性进行性病程，无特效治疗方法，口服维A酸类及外科手术治疗有32 山东大学硕+学位论文一定疗效田J1，但远期疗效不佳，易复发。本病的发病机制尚未明确，随着分子遗传学的发展，许多学者对该病的致病基因及其功能做了大量的研究，目前已定位克隆鉴定出两个与残毁性掌跖角化病有关的致病基因：分别是定位在13号染色体13q¨。12上编码缝隙连接蛋白Cx26的GJB2基因和定位在l号染色体1q21上编码兜甲蛋白的LOR基因。由GJB2基因突变导致的残毁性掌跖角化病常伴有听力异常，被称为典型的残毁性掌跖角化病伊删；由LOR基因突变导致的残毁性掌跖角化病常伴有鱼鳞病，被称为变异型残毁性掌跖角化病m，删。也有报道听力损害和鱼鳞病发生在同一残毁性掌跖角化病的病例以及均未伴有的家系中n羽。2残毁性掌跖角皮症与GJB2基因GJB2基因在1992年被克隆出并定位于染色体13qll—q12上，该基因全长4804bp，编码区为678bp，含2个外显子，但编码区仅位于下游外显子上，编码含有226个氨基酸缝隙连接蛋白26(Cx26)，因此很容易通过PCR扩增并测序分析。Cx26是缝隙连接大家族中的一员，属于B一2型缝隙连接蛋白。缝隙连接蛋白(co肌exin，Cx)是缝隙连接的物质结构基础，参与细胞间信息传递、物质运输及生长调控等，据文献报道，它与肿瘤的发生关系密切。缝隙连接存在于几乎所有类型的细胞表面，为电突触的结构基础，它是相邻细胞膜间信细传递的通道，只允许细胞间离子及小于1KD的代谢小分子物质通过。当细胞接受刺激后，细胞膜内外电势改变，缝隙连接通道开放，将离子及其它调节物质(如第二信使)传递给相邻细胞，使之产生相应反应。每个缝隙连接由相邻细胞间包膜上的连接子(connexon)锚定形成，每个连接子又有六个相同或不同的缝隙连接蛋白组成，它可以调节通道的开闭，从而选择性让小分子物质通过。迄今为止，在缝隙连接蛋白大家族中至少发现了20多个成员，分子量均在26～56KD之间，分为Q—Cx和B—Cx。连接蛋白有着共同的结构基础：四次跨莫将其分为五个区，即N端、C端区，跨膜区(TM卜4)，细胞外区(E1和E2)，细胞内区(CL)。N端与TMl之间的胞内区构成电压感受器的电荷复合体，E1与E2区决定连接蛋白之间的相容性，CL和C端区与间隙连接通道的PH门控有关。连接蛋白基因突变可产生无功能或功能缺陷的连接蛋白，使缝隙连接缺损，通道开闭异常，从而导致细胞间信息传递受阻或紊乱。33 山东人学硕士学位论文1997年Kelsel等n钉对一同时患有遗传性掌跖角化病伴深度感音神经性耳聋的家系进行致病基因检测时发现所有患者GJB2基因均发生了一个杂合错义突变101T—C，使Cx26N一末端区域第34位氨基酸，导致甘氨酸(G1y)被精氨酸(Arg)替代，即M34T突变。1997年人们发现GJB2基因与遗传性非综合征性耳聋(NSHI)关系密切相关，而且经研究发现235delC是该病最常见的突变类型。经免疫组化证实，在声音传导过程中内耳非感觉上皮细胞和组织细胞表达的Cx26蛋白，对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调控作用。GJB2基因突变后导致K+进入内淋巴液受阻，从而导致感音神经性耳聋。1999年，Maestrini等阳1对三个来自不同国家(英国、西班牙和意大利)的残毁性掌跖角化病伴感音神经性耳聋家系进行研究时，通过连锁分析首次将本病的致病基因定位在13号染色体q11一q12上，在对GJB2基因进行基因序列分析时发现，在三个毫无关系的家系中所有患者的GJB2基因均存在一个杂合错义突变196G—C，导致第一细胞外区域第66位天冬氨酸被组氨酸替代(即D66H突变)，而家系中所有正常人的GJB2基因测序结果均未发现此突变。此结果说明D66H是残毁性掌趾角皮症伴感音神经性耳聋的致病基因，导致Cx26分子的第1个细胞外区的1个高度保守的残基发生改变，进而干扰连接小体的组装，以及Cx分子锚定于邻近细胞和在缝隙连接中所起的门控功能。进一步研究表明所有患者均为携带该突变基因的杂合子个体，由此作者证实该突变为常染色体显性遗传性聋的病因之一。2005年，RikkertL．Snoeckx等n目在分析埃及耳聋患者中GJB2基因突变时，其中有一个伴有Vohwinkel综合症的家系，患者为父子两人，均有弥漫性掌跖角化伴深度感音神经性耳聋，父亲右足的第2，3趾有纤维性缩窄环，即假一阿洪病样表现。在对该家系进行GJB2基因序列分析时发现一个新的突变位点p．Glyl30Val(G130V)，此点是位于GJB2基因高保守区域的一个显性突变。该家系正常人中未发现此突变。据说GJB2基因的显性突变导致听力异常和皮肤病可有不同程度外显率n即，所以该家系中儿子未有典型的假阿洪病样表现。在VS致病基因中，G130V是唯一位于GJB2基因的第二细胞外区域的突变位点。Marie—LouiseBondeson等‘133于2006年对瑞典一vs患者做GJB2基因突变检测时发现另一个新的突变位点p．Gly59Ser(G59S)，患者为一60岁的老年男性，掌 山东大学硕上学位论文跖弥漫性角化过度增生，呈蜂窝状小凹，指趾可见假阿洪病样改变，同时伴有先天性聋哑和泛发全身的鱼鳞病。突变点位于GJB2基因的第一个高度保守序列的非保守突变。该患者父母早逝，无子女，G59S为一新发突变，并最终发展为基底细胞癌和鳞状细胞癌。2011年，deZWart—Stormn刀等，发现了第四个引起残毁性掌趾角皮病的突变位点，p．Tyr65His(Y65H)，该位点与1999年Maestrini等发现的突变位点(D66H)紧紧相邻，相邻的两个密码子突变引起相同的临床表型，这在GJB2基因上还是第一次见到。至今，在GJB2基因上共发现以上4种突变类型与典型残毁性掌跖角皮症有关，均为单一碱基杂合错义突变，说明部分氨基酸残基在该病的发生发展中起着重要的作用。有研究报道，D66H和Y65H突变形成的突变型Cx26在细胞中分布和结构异常，导致其形成的缝隙连接通道功能障碍，采用细胞荧光免疫示踪法(parachuteassay)检测到由突变型Cx26构成的连接通道对染料的转移较野生型Cx26明显减少∞·”，181。GJB2基因突变是引起常染色体隐性遗传性非综合征性耳聋(NHSI)的主要原因，大约一半以上是由该基因突变导致。目前已作为儿童先天性耳聋的常规筛查基因[15]。由GJB2基因突变导致残毁性掌跖角皮症患者也均伴有听力异常，而兜甲蛋白基因突变无听力障碍，但常伴有鱼鳞病。3残毁性掌跖角皮症与LOR基因LOR基因定位于1q21上，其DNA全长为1206bp，编码316个氨基酸的兜甲蛋白。兜甲蛋白是组成角化细胞膜的其中一个蛋白，变异的兜甲蛋白可以在细胞核内积累并最终干扰角化细胞终末分化的凋亡过程n螂1。1996年，Maestrini等n们对美国一残毁性掌跖角化病伴鱼鳞病的大家系进行研究时，通过连锁分析将该家系致病基因定位在1q2l上，在对LOR基因序列分析时发现第730位插入一个碱基G，从而改变了C末端富含甘氨酸一谷氨酸一赖氨酸的翻译结构，导致角化破坏。1997年，Korge等＆蛆对德国两个不同临床表现的家系进行分子学研究，一个伴有鱼鳞病，另一个伴有耳聋。同样在伴有鱼鳞病的残毁性掌跖角皮症家系中发现730insG突变，证明了兜甲蛋白突变仅见于伴有鱼鳞病的VS患者中。同时也35 山东大学硕上学位论文验证了两者在临床和超微结构上有很大的不同。1998年，A瑚strong等蚴，对北爱尔兰一伴有鱼鳞病的VS家系分析发现在LOR基因上第209个密码子处有单一碱基T插入(662insT)。使终止密码延迟，导致107个氨基酸移码突变并新增22个氨基酸。1999年，Takahashi等幢31对日本一VS伴有泛发的鱼鳞病同时伴有感音性耳聋的患者进行研究，患者是一名20岁青年女性，家族中无类似病史，该患者无典型的海星状角化损害，在对该患者10ricrin基因进行序列分析时发现第231位密码子插入一个G(即730insG突变)，导致移码突变和异常的C末端。伴有鱼鳞病的残毁性掌跖角皮症较伴有听力异常的更为少见，至今，国内外共发现8个患该病的家系，3种突变类型，分别是：730insG，662insT和709insCn吼％捌，均为单一碱基插入突变。8个家系中有6个家系的突变方式为730insG，可见在LOR基因上730insG是导致该病的热点突变。730insG突变导致移码突变和异常的C末端，改变了C末端84个氨基酸并且比野生型兜甲蛋白增加了22个氨基酸，致使富含谷氨酸／赖氨酸的序列改变为富含精氨酸／亮氨酸序列，此结果同样出现在4个不同的国家(英国、日本、苏格兰、德国)中，说明在不同的种群中存在相同的突变热点。在仅有耳聋的vs家系中未发现该突变，说明此突变仅存在于伴鱼鳞病的VS家系中。2000年，Suga等阱1在鼠的Loricrin基因编码序列的1190核苷酸的位置上插入一个碱基C，成功制造了Loricrin转基因鼠的模型，转基因鼠的皮肤表现类似于残毁性掌跖角皮症伴有鱼鳞病的病人的临床表现，同时也证明了鼠变异兜甲蛋白的羟基端含有一个核定位序列(NLSs)，他们把敲掉的Loricrin基因鼠与转基因鼠交配，证实可有更为严重的表型。4问题与展望缝隙连接蛋白26(Cx26)的基因突变在皮肤疾病及听力异常中的作用尚未完全清楚。其基本的分子机制可能为：GJB2基因突导致缝隙连接蛋白26结构及其在细胞中的分布异常，从而导致缝隙连接通道障碍，进而影响细胞间小分子物质的传递及信号的传导。由于变异型残毁性掌跖角皮症更为罕见，临床病例较少，以至于给该病的基础研究带来一定的困难，而且该病的临床表型与基因型的关系也不易得到。各患 山东大学硕j￡学位论文者家系中不同的临床表现可能是该病表型的连续，因而引出了存在其它相关基因的假设：LOR基因的多态性或存在不同的修饰基因，从而导致了变异型残毁性掌跖角皮症的临床表型多样化并影响了其发病机制。虽然现在众多学者已对该病做了大量的研究，但目前残毁性掌跖角皮症的致病基因及发病机制仍不十分清楚，依旧处于探索阶段，由于该病比较罕见，在积极总结前人研究成果的基础上，我们要继续收集患者家系，并对其进行基因检测，丰富遗传资源。另一方面从基因功能研究上探索该病的发病机制，为今后对该病的诊断及治疗打下坚实的理论基础。参考文献【l】Vohwilll(elKH．斯atomaheredit撕啪mutil锄s[J】．ArchD锄atolSyp惋lol，1929，158：354_364．[2】WiglcyJEM．Acaseofhyperk蹦肋sispaJm撕setplallt撕sassociatedwimaillll啪-likeconstrictionofⅡlefingers．BrJDenna协l，1929，4l：188·191．[3]冯兰珍，徐素芹，梁祖棋，等。毁性掌跖角皮症伴白癜风1例[J]。中国皮肤性病学杂志，2004，18(4)：242—243．[4】Sen．觚oC嬲仃oPJ，Nar删oF锄锄dezC，QuirogaSubiranaP’eta1．VohwiIlkelSyndromeseconda巧t0misseIlseInutationD66HiIlGJB2g吼e(co蛐％ill26)c锄include印il印ticmaIlifestatio璐．Seizllre'2010，19(2)：129-131．[5]马东来，胡瑾，方凯。Olmsted综合症国内首报[J]。临床皮肤科杂志，2006，35(10)：637—639．[6】SiVay砒omA，Ton印al【S．MutilatingKeratodenIlaofVohwilll(el：success列讹她entwimen娥ina_te．JMedAssoc111ai，1985，68(10)：546—551．【7】Basse№F'Tien90C，Sf．e玎azzaR，cta1．Voh丽Ill【els”drome：骶a缸nentofps印do·aillll啪．IntJDemat01．20lO，49(1)：79—82．【8】硒dl莉GRo啪F’WilloughbyCE，eta1．Miss％semutationsinGJB2饥codingco衄exin-26cauSeⅡleectodenIlaldysplasiakeratitis·ichthyosis—dea血esssyndI。ome．Am．J．Hum．G肌ct，2002，70：134l-l348．【9】MaestriniE，Ko唱eBP，Oc蚯a—Sien．aJ，eta1．AIIliss吼semutationinCoIlIlexiIl26，D66H，causesmutilatingkeratode加awimsellso血euraldea伍eSs(Vohwinkel’s37 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山东大学硕士学位论文【20】DreraB，TadiIliqBalboF，eta1．Denov0occ咐eIlceofme730insGrecu玎％tmutationill觚Itali龇觚ilywiⅡlmeichmyoticV撕alltofVoh谢lll(e1syndrome，loric血keratode眦a．ClinG锄et，2008，73(1)：85—88．【21】KoFgeBP，Ishida—Y细锄ot0A，PurltcrC，et．a1．LoricrinmutationiIlVohwilll【d’skeratod锄aisu11iquetonleV撕a11twinlichnlyosis．JhlVestDcnIlatol，1997．109：604—610．【22】知msn．ongDKB，McKellIlaKE，Hu曲髂AE．Anovclins哪ionalmutationin10riQrinill、厂ohwiIlkel’skeratode衄a．JInvestDenIlatol，l998，11l：702-704．【23】Isllida-Y．黝锄ot0A，McGranlJA，L锄H，eta1．Them01ecularpathologyofpro国旧ssivesyl如【n矧cerytlll．0keratodenna：a仔锄eshiRmutationiIlmeloricringene觚dpeftmationsintlleconlifiedcdl饥、，elope．AmJH啪Gellet，1997，61：581-589．【24】SugaYJanlikM，AttarPS，eta1．TraIlsgellicmiceeXpressingamutantfonnoflo打耐nrcvcaltllemolccularbasis0fmeskiIldise豁鼯，、，0h、斩nkelsyndromeandpI．09ressiVesymnletricerytlⅡokeratodenna．JCellBiol，2000，151：40l一412．39 山东大学硕上学位论文致谢呈现这篇论文的同时，亦奉上我最真诚的谢意和敬意!今天，我首先要衷心感谢我的导师张莉教授!感谢张老师在我三年研究生学习生涯中给予我的关心、教诲和爱护!张老师博大的胸怀、渊博的知识、谦逊的人品、精湛的技术、雷厉风行的工作魄力及富有创造力的思维方式，使我耳濡目染，受益终生。在此即将毕业之际，向张老师三年来对我在学业上的悉心指导和生活上的关怀帮助表示由衷的敬意和诚挚的谢意。同时，我也要真诚感谢皮肤科戴文丽教授、张树孝教授、王承顾教授、刘洪义教授、万俊曾教授、于志湖教授、任忠芬副教授、孙志坚教授、周淑华教授、杨安波教授、魏欣净教授、金德蕙副教授、王红副教授、李颂副教授及科室其他老师们三年来不倦的教诲，他们正直的人品，高尚的医德，对事业锲而不舍的追求精神是我毕生学习的楷模!非常感谢皮肤科实验室陈瑞娥、路麒、施岩老师三年来对我学习及生活上的帮助，他们认真的工作态度、乐于助人的精神使我深受感动，在此表示诚挚的感谢!真诚感谢师兄弟姐妹王震英、宋亚丽、李圆圆、郭亚楠、陈楠、陈腊梅、聂小娟、刘雯敏、孟宪敏、温广东、宋秀风、张本利、张杰、郭小璇、姬灿灿等在学习和生活上给予的热情帮助，难以忘怀和他们共同拼搏的日子，他们让我感受到了真诚的友谊和温暖，我将永远铭记这段不平凡的岁月。特别感谢所有提供血样及家系资料的家系成员，谢谢你们的无私奉献!最后，深深感谢我的父母、家人、朋友多年来对我无微不至的关怀和呵护，是你们的理解、爱护和支持给了我晴朗的天空和前进的力量!谢谢你们! 山东人学硕士学位论文攻读学位期间发表的学术论文目录1．王占想，陈楠，宋亚丽，等．一残毁性掌跖角化病家系致病基因突变研究．中华皮肤科杂志，2012，45(5)：344—346．第一作者2．王占想，宋亚丽，陈楠，等。一有汗性外胚叶发育不良家系致病基因突变筛查．中国麻风皮肤病杂志，2012，28(6)：第一作者3．QiuYing，WangZhanxiang，ChenNan，eta1．D66HmutationinGJB2geneinaChinesefamilywithclassicalVohwinkelsyndrome．IndianJDermat01VE．已接收，并列第一作者4．山东地区银屑病患者CYP3A5基因多态性分析及其与环孢素A疗效、毒副作用的关系。第一作者，待发表。5．金德蕙，宋亚丽，王占想。山东地区银屑病患者亚甲基四氢叶酸还原酶基C677T多态性检测及其与MTX疗效、毒副作用的关系。中国麻风皮肤病杂志，2012，28(8)：已接收，第三作者4l 学位论文评阅及答辩情况表专业技术是否博导总体评姓名所在单位职务(硕导)价※论田搏尚擞瞧、锣曲枘燃飘翩叩绮征|~又评郧冻违教．袭舡止东怨确酗萏阅人专业技术是否博导所在单位姓名职务(硕导)主席王玉磷教授足山东夫学膏留医陶琴像芝教娩爰幽东犬勋隧匠陬答辩旧僻南苏缒旯燃划蝴隔绷翻’、‘—一委员委凰溯燃磊幽加噬韶舷陶会麟墼敦艇西从床黼翩组翻成员答辩委员会对论琳?答辩日文的总体评价※噬答辩秘书铬弛．期弘f≯．j．必备注※优秀为“A，’；良好为“B”；合格为“C”；不合格为“D”．