食源性致病菌快速检测方法的建立及其试剂盒的研制与应用

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1、山东农业大学硕士学位论文食源性致病菌快速检测方法的建立及其试剂盒的研制与应用姓名：周明东申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：赵宏坤20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素。近年来，食品安全事件频发，不仅影响到人们的生活、工作和健康，更是关系到国计民生的大事。随着经济的发展和人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到重视。我国流行的食源性疾病中，细菌性食物中毒居首位，因此，食品中食源性致病菌检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌、致病性大肠杆菌、弯曲杆菌、副

2、溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌属、阪崎肠杆菌、李斯特菌、结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌等。面对日益增加的多重混合污染，目前的检测方法显得滞后，因此建立快速、高效、准确的食源性致病菌的检测方法已成当务之急。多重PCR是在同一PCR反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。克服了常规PCR方法单一、费时、繁琐等缺点，从而实现了多种食源性致病菌的快速同时检测，多重PCR检测方法有着更为广阔的发展空间。本研究针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter]ejuni)、副溶血弧菌(mrfD。parahaemol

3、yticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumpe矿ingens)、奇异变形杆菌一(Proteusmirabilis)6种食源性致病菌建立了多重PCR快速检测方法。分别根据空肠弯一曲杆菌的马尿酸酶hipO基因、副溶血弧菌的不耐热溶血毒素tlh基因、小肠结肠炎耶尔森菌的粘附侵袭位点Ail基因以及阪崎肠杆菌的16S核糖体16SrRNA基因、产气荚膜梭菌的磷脂酶cpa基因、奇异变形杆菌的Tu延伸因子tuf基因设计6对特异性引

4、物，PCR扩增的目的基因片段长度分别为1028bp、450bp、274bp、282bp、120bp、541bp。建立多重PCR检测方法，并研制出两套三重PCR试剂盒，实现了6种食源性致病菌的同时检测。对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素通过L20(55)正交试验确定最佳反应体系，确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序，即优化的三重PCR反应体系为：509L反应体系中，10xPCRBuffer59L，M92+(25mM)31xL，dNTPmixture(25mM)41xL，Taq酶(

5、5U)1此，模板各2“L，hipO、tlh和Ail终摩尔量分别为15pmol、5pmol和7．5pmol，16SrRNA、cpa和tuf终摩尔量分别为5pmol、15pmol和5pmol，双蒸水补足至50肛L；两套多重PCR试剂盒扩增循环参数为：多重PCR反应采用冷启动，94"C预变性5mira然后变性(94。C，30s)，退火(57"C，食源性致病菌快速检测方法的建立及其试剂盒的研制与应用40s)，延伸(72℃，70s)，35个循环，最后72℃延伸15min。反应产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对多重PCR扩增产物胶回收后

6、连接到pMDl8-T载体上转化进大肠杆菌DH5ct中，阳性克隆质粒进行DNA测序，登录Genebank将测序结果进行网上blast同源性比对，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。．试验中利用人工污染的肉及乳制品，对6种食源性致病菌的特异性、灵敏度进行同时检测。其中副溶血弧菌、阪崎肠杆菌和产气荚膜梭菌的多重PCR灵敏度与单重PCR相比，低一个梯度；而其他三种致病菌与单重相比灵敏度不变。空肠弯曲杆菌的检出极限为3．0x101cfu／ml，副溶血弧菌的检出极限为6．2x10‘cfu／ml，小肠结肠炎耶尔森菌的检出极限为1．5×101cfu／ml；阪崎

7、肠杆菌的检出极限为1．9x10’cfu／ml，产气荚膜梭菌的检出极限为5．8x101cfu／ml，奇异变形杆菌的检出极限为2．4x101cfu／ml。应用本试验研制的两套三重试剂盒，对泰安地区食源性致病菌的流行情况进行实际样品检测。从泰安各农贸市场、家禽屠宰市场、家禽零售处、家禽交易市场等采集鸡的粪便、羽毛、新鲜鸡肉、冷冻鸡肉及其屠宰用水、屠宰用具等样品409份；从泰安某奶牛场和超市采集新鲜牛奶及奶粉样品392份。经检测，样本中85份检出空肠弯曲杆菌，阳性率20．8％，6份检出副溶血弧菌，阳性率1．5％，54份检出小肠结肠炎耶尔森菌，阳性率13．2

8、％；1份检出阪崎肠杆菌，阳性率0．1％，48份检出产气荚膜梭菌，阳性率6．O％，48份检出奇异变形杆菌，阳性率6．O％。将