牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立.docx

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1、牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有:奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见

2、,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。进一步经过引物

3、筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。对多重LAMP反应体系进行特异性和灵敏度检测。在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。在灵敏度检测中单增李斯特菌的灵敏度为23fg/μl,沙门氏菌和志贺氏菌的灵敏度为250fg/μl,相较PCR灵敏度提高了一个数量级。将三种致病菌菌液稀释成不同浓度,并污染牛奶样品,煮沸法提取基因组DNA,进行多重LAMP检测。单增李斯特菌的最低检出限为9.47×101CFU/ml,沙门氏菌的最低检出限为4.1×102

4、CFU/ml,志贺氏菌的最低检出限为5.33×101CFU/ml。2.针对单增李斯特菌hly基因、沙门氏菌fim基因和志贺氏菌ipaH序列的高度保守序列设计引物,根据扩增产物的溶解温度选择引物,经引物浓度和温度优化,建立针对三种食源性致病菌的多重HAND-HRM反应体系。对多重HAND-HRM反应体系进行特异性、灵敏度和稳定性检测。在特异性检测中含有目标菌的模板出现熔解曲线峰,空白对照和非目标菌均未出现熔解曲线峰,判断该多重HAND-HRM反应体系特异性强。在灵敏度检测中单种致病菌检测灵敏度分别为:单增李斯特菌和沙门氏菌的灵敏度为10fg/μl,志贺氏菌的灵敏度为1OOfg

5、/μl。三种致病菌在同一体系中检测的灵敏度为:三种致病菌均为100fg/μl。在稳定性评价中,Tm值的组内CV值分别为:单增李斯特菌0.10%-0.25%,沙门氏菌0.04%-0.22%,志贺氏菌0.18%-0.69%。Tm值的组间CV值分别为:单增李斯特菌0.16%-0.34%,沙门氏菌0.27%-0.38%,志贺氏菌0.41%-1.18%。三种致病菌检测的组内和组间CV值较小,说明该多重HAND-HRM体系的稳定性较强。当三种致病菌模板浓度比例不同时,对多重HAND-HRM体系检测结果的影响进行评价的结果表明,模板浓度都处于较低水平且相差过大时,高浓度模板对低浓度模板的

6、扩增有一定抑制作用,但通过增菌培养可以消除这种抑制。将单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌菌液稀释成不同浓度,污染牛奶样品,建立模拟污染牛奶模型,煮沸法提取基因组DNA,进行多重HAND-HRM检测。单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌的最低检出限为102CFU/ml。在73份实际样品检测中,多重LAMP检测体系检测灵敏度与国标法一致,多重HAND-HRM体系的灵敏度甚至高于国标法。在实际应用尤其是大量样本检测中,可先利用多重LAMP体系进行初筛确定是否含有致病菌,再通过多重HAND-HRM体系确定含有何种致病菌。本研究建立的快速检测体系特异性强、灵敏度高,稳定性

7、强且成本低、易于操作,具有较强的应用价值。