引入扩增内标的食源性致病菌多重pcr检测方法的建立与应用

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1、万方数据DevelopmentandapplicationofinternalamplificationcontrolformultiplexPCRdetectionoffoodbornepathogens．Ik—The"submittedt01laeSlSSUQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofEngineeringJiangYanjun(CollegeofFoodScienceandEngine

2、ering)Supervisor：ProfiZhaoHongkunQingdao．Chm．aJune，2013万方数据独创性声明嗍嗍哪咖嘲傩㈣哪删Y2663337本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研燃名：锄时间：汐1弓年易月。x目关于论文使用授权的

3、说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：獭时间：砂J弓年易月力日导师签名：时间：汐7≥年名月．砂日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要引入扩增内标的食源性致病菌多重PCR检测方法的建立与应用摘要近年来，应用PCR方法进行快速检测食源性致病菌的报道较为多见，但由于其

4、结果常常出现假阳性或假阴性而存在质疑。本研究针对这一问题，以畜禽体内常见的两种肠道致病菌一一沙门氏菌、大肠杆菌0157：H7为目的菌，对常规的PCR方法加以改进，并进行了实际应用，获得了更为准确的检测结果。本文就该项试验的全部过程报告如下。选择具有特异性的沙门氏菌invA基因、大肠杆菌0157：H7∥iC基因作为靶基因，设计引物，改良二重PCR方法。试验过程中对影响PCR扩增的三种主要因素～一引物浓度、M92+浓度、退火温度进行优化，确定了适宜的二重PCR反应体系和扩增程序：509L反应体系中，10×PCRBuffer5

5、9L，dNTP终物质的量为10pmol，M92+终物质的量为75pmol，2．5UTaq酶，沙门氏茵、大肠杆菌0157：H7引物终物质的量均为10pmol；扩增程序为：预变性94℃，5rain；变性：94℃，30s，退火：60℃，40s，延伸：72℃，40s，30个循环；延伸：72"C，10min，4℃保存。特异性试验中，加入其它7种常见的食源性致病菌，引物无非特异性扩增，人工污染鸡肉、牛肉、猪肉样本，两种致病菌的检出限均可达2×101CFU／ml，模拟实际样本检测，加入高浓度背景菌群，当背景茵群浓度为107CFU触、1

6、08CFU／ml时，102CFUtml、103CFU／ml沙门氏茵和大肠杆菌0157：H7均可检出，'-3背景菌群浓度为109CFU／ml，103CFU／ml沙门氏菌和大肠杆菌0157：H7均可检出。未检出样本增菌6h后，又可检出这两种待检目的茵。在与传统培养方法试验结果对比中，PCR法与其结果一致，证明了该法的准确性。为避免PCR假阴性结果的出现，本次研究设计了一段人工构建的DNA序列作为扩增内标(IAC)引入PCR体系中以指示假阴性，该序列不仅与两种待检菌沙门氏茵、大肠杆茵0157：H7的目的基因同源性很低(分别为3

7、．61％、4．42％)，而且与其他常见的食源性致病菌的同源性均很低，因此可用于其他致病茵的PCR检测。通过两次克隆试验得到扩增内标，其PCR扩增产物纯化后引入已优化的二重PCR法中，得到不影响原二重PCR灵敏度的最优IAC浓度0．4留pl。以禽肉样本均质液为抑制物，倍比稀释后加入队C-PCR体系中，测定抑制物对IAC及目的基因的影响，加入1／32原抑制物浓度时，IAC较两目的条带在较高浓度先消失，即抑制物对IAC的影响大于对两目的条带的影响，证明了执C可有效指示假阴性结果。传统培养方法、PCR法、IAC．PCR对比试验万

8、方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要中，IAC．PCR有效指示2份假阴性结果，进一步证实了IAC．PCR法的检测优势。本研究优化的二重PCR法可快速准确检测沙门氏茵、大肠杆菌0157：H7，改进的IAC．PCR法可有效指示假阴性结果，为食源性致病菌的快速检测提供了有效的技术手段，可用于食品及其制品的日常生物安全监测。关