小鼠骨骼源成熟树突状细胞的分离培养、纯化及鉴定

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1、河北医科大学硕士学位论文小鼠骨骼源成熟树突状细胞的分离培养、纯化及鉴定姓名：王金丽申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：郭力201203中文摘要小鼠骨髓源成熟树突状细胞的分离培养、纯化及鉴定摘要目的：树突状细胞(dendriticcells，DC)是迄今为止人类发现的唯一能够刺激初始T细胞的活化增殖和功能最强大的抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，其可介导抗原转移，在体内激活静息T细胞，启动特异性免疫应答。多发性硬化(muitiplesclerosis，MS)是主要以T细胞介导的中枢神经系统

2、慢性炎症性脱髓鞘疾病，它的发病机制虽然仍未得到完全明确，但众多研究表明，MS的发生与T细胞异常活化有关，并且，MS的病理免疫应答与DC的参与有直接关系。基于DC的特性，近年来，将DC用于自身免疫性疾病的研究已得到深入开展，特别是将其应用于多发性硬化的治疗己成为目前的研究热点。因此，能够正确、高效的分离培养出DC并对其进行鉴定是运用DC开展下游实验的基础与前提。我们设计了本实验，旨在用rmGM．CSF、rmlL．4及TNF．Q在体外诱导培养小鼠骨髓源成熟树突状细胞与免疫磁珠分离纯化相结合的方法获得DC并对DC从形态学观察、细胞表

3、面分子的检测及刺激T细胞增值能力三方面进行鉴定，探讨及优化小鼠骨髓源成熟树突状细胞的分离培养、纯化及鉴定方法，为进一步研究DC在多发性硬化治疗方法中的应用提供实验基础。方法：1．骨髓源性成熟DC的分离及培养将C57BL／6小鼠用拉颈法处死后浸泡在75％乙醇中3．5分钟，无菌取出下肢骨，用注射器针头在长骨两端扎眼使髓腔联通，用注射器吸少量RPMI．1640培养液将骨髓冲出，用200目滤网过滤后加入红细胞裂解液溶解红细胞，RPMI．1640培养液洗涤细胞，然后用RPMI1640完全培养液(含10％胎牛血清、rmGM-CSF(10n

4、g／m1)、rmIL一4(IOng／m1))调整细胞浓度至106／ml，接种于6孔培养板中，将细胞培养板放入370C、含5％c02的培养箱中培养，第6天加入rmTNF—a(15ng／m1)至细胞培养板中并继续培养，至第7天收集细胞培养板中所有的悬浮细胞，此即为小鼠骨髓源性的成熟DC。中文摘要2．CDllc免疫磁珠分离纯化DC．2．1使用CDllc免疫磁珠标记DC-对DC进行计数，重悬于缓冲液中。加入CDllc免疫磁珠，于2—8oC孵育15分钟后重悬于缓冲液中。2．2使用磁珠分选器分离DC．将LS柱放置在MiDiMACS磁珠分选

5、器中，加入适量缓冲液润洗LS柱。将磁珠标记的细胞悬液放入分选柱中，收集流出物，这是未标记的阴性细胞。将分选柱从分选器上移下，加入5ml缓冲液，用配套活塞将标记细胞推出来，此即为纯化后的成熟DC。3小鼠骨髓源成熟树突状细胞的鉴定3．1细胞形态学观察3．1．1在倒置荧光显微镜下对DC形态进行观察。3．1．2扫描电镜对DC形态进行观察并拍照。3．1．3透射电镜观察并拍照。3．2流式细胞仪检测细胞表面分子：收集细胞培养板中的悬浮细胞，经离心、洗涤、计数、定容、标记后分别加入抗体，室温避光孵育20分钟后离心、洗涤后使用流式细胞仪检测DC

6、表面CDllc、CD80、CD86、MHCll分子的表达情况。3．3采用细胞增殖检测试剂(CCK．8)法测定单向混合淋巴细胞反应(one-wayMLR)中的DC对同种异基因T细胞刺激增殖的能力：(1)取C57BL／6小鼠骨髓中的成熟DC作为刺激细胞，方法同前。(2)提取BALB／e小鼠脾脏中的T细胞作为反应细胞，并取部分T细胞做分选前流式检测(3)采用CD90免疫磁珠分离纯化T细胞。(4)流式细胞仪检测T细胞纯度。(5)DC与T细胞共培养：DC与T细胞的比例分别设定为1：5、1：10、1：20、1：40，共培养72小时，于培养

7、结束前4小时加入CCK．8，每孔20pL，继续培养4小时并于加入CCK-8后的第2、3、4小时分别上酶联检测仪检测一次，记录吸光度值。结果：1．成熟DC的形态观察1．1倒置荧光显微镜观察：小鼠骨髓细胞经GM．CSF、rmlL-4诱导培养48小时可见大部分细胞贴壁生长，细胞形态大小不等，培养72小时后悬浮细胞较前增多，部分细胞形成集落。培养第6天可见悬浮细胞继续增多，并可见少量树突样突起。加入rmTNF．Q培养24小时后细胞表面出中文摘要现典型的树枝样突起，完全符合典型成熟DC的形态。1．2扫描电镜下观察：DC形态多样，结构完整

8、，表面粗糙，好似覆盖着一层薄纱，细胞表面粗糙，有大量褶皱及树枝样突起，符合典型的成熟DC的形态。1．3透射电镜观察：DC胞体较大，形状不规则，细胞表面有较长的树枝状突起，长短不一，粗细不均；胞核形态多样，可见清晰的核膜；胞浆内细胞器丰富，可见大量的高尔基体、内质网、线粒体及核