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1、树突状细胞的分离纯化与鉴定自从Stciman首次发现树突状细胞(dendriticcell,DC)以来,人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入,认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC。DC的纯化方法包括两大类:(1)物理方法:①根据细胞的黏附性进行分离,有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法,各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞>DC=抗体产生细胞>B细胞>T细胞;②根据细胞的大小比重进行分离,包括聚蔗糖2泛影葡胺(Ficoll2Paque)密度梯度离心、Perco
2、ll非连续性/连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离;(2)免疫分选:包括淘洗法(Pan2ning)、流式细胞术(fluidcytometry,FCM)、磁性细胞分离术(MACS)。以下就不同组织DC的分离作一综述。1从外周血直接分离DC首先分离外周血单个核细胞(PBMC)。常用方法有:(1)Ficoll不连续密度梯度离心,将人外周抗凝血稀释置于Ficoll2Paque淋巴细胞分离液上离心,速度(170g～1000g)和时间(20～45min)因各个实验室而异,分离液与血浆之间的界面层细胞即是PBMC;(2)Percoll连续/不连续密度梯度离心:方
3、法基本与密度梯度离心相同,可在Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化DC。玫瑰花沉淀法大体上可将PBMC分为ER+和ER2细胞,其中ER+主要是T细胞。Nijman采用磁珠阴性选择法,即用与抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56单抗相连的磁珠分别去除ER2细胞中的单核细胞、B细胞、NK细胞和粒细胞,所得的“新鲜DC”(f2DC)纯度经流式细胞术(FACS)检测达到85%～90%。如果将ER2细胞培养36h再加2次各40min贴壁培养去除黏附细胞,将未黏附细胞置于1415%甲泛葡胺上离心去除B细胞、NK细胞,可得到90%～95
4、%纯度的“培养DC”(c2DC)。f2DC和c2DC分别具有未成熟DC和成熟DC的典型特征。Young的一种方法是用Percoll分离液先分离PBMC中的单核细胞,或玫瑰花法得到的经短暂培养去除黏附细胞的ER2细胞;另一种方法是先用玫瑰花节法分离出ER2细胞,培养36h去除单核细胞和黏附细胞,两种方法最后将所得细胞经Percoll密度梯度离心,高密度部分富含B细胞,低密度部分DC纯度为40%～80%Thomas则用L亮胺酰2L亮胺酸2甲基酯(LLME)处理ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞,再经14-15%1的甲泛匍胺RPMI164
5、0溶液(含10%FCS)离心,低密度部分富含DC;再用免疫磁珠分选出CD14、CD19、CD16、CD3和CD33+CD14dim细胞,证实为DC前体细胞,>90%表达CD33+CD13+。最近有报道用免疫磁珠连接单抗M2DC8从PBMC中一步分离出一类DC(占血白细胞015%～1%),其纯度为97%,这可能是至今为止最简捷的分离方法。该细胞具有DC的典型特征:递呈抗原给静息T细胞、诱导MHCI限制性CTL应答,表达CD86、CD40。与单核细胞相比,它低水平地表达HLA2DR、CD33、CD45RO,高水平地表达CD45RA、CD11c,它特别
6、高水平地表达FcγRIII(CD16),使它与单核细胞区别开来。这类细胞与已经确立的一般骨髓源性DC的区别在于表达M2DC8,缺少CD83和胞浆内p55抗原,因此它可能代表中间阶段(intermediatedevelopmentalstage)的DC细胞。2从DC前体诱导扩增DCò从CD34+干细胞前体诱导扩增DCCaux用抗CD34mAb和GAMIgG免疫磁珠、minimacs分离柱从人脐血中获得高纯度的CD34+HPCs(80%～99%),将其置于RPMI1640全培养基中(加有SCF、GM2CSF和TNF2α及人AB+血清)培养;5～6d后
7、洗去人血清,用FITC2OKT6(CD1a)和PF2leu2M3(CD14)单抗标记培养细胞,经流式细胞仪分选出CD14+CD1a和CD14、CD1a+亚类,以(1～2)×105/ml的浓度接种到含GM2CSF和TNF2α的培养基中再培养6～7d,可获得相当数量的DC,证实CD34+细胞可分化《上海免疫学杂志》2001年第21卷第2期©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.为两种细胞:LC型DC和CD14源DC(具有强大的抗原摄取和独特的诱导静息B细胞
8、分化为IgM分泌细胞的功能)。Ahuja用Ceprate干细胞收集系统获得CD34+PBHP(含10%FBS)他用改良lscov‘sDM
