转移抑制基因mtss1在胃癌侵袭转移中的研究

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1、第二军医大学博士学位论文转移抑制基因MTSS1在胃癌侵袭转移中的研究姓名：柳珂申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：王杰军201206转移抑制候选基因MTSSl在胃癌侵袭转移中的研究摘要胃癌所具有的高转移特性是该类型肿瘤预后较羞的主要原因，深入探索其相关机制对提高患者生存率意义重大。候选基因MTSSl作为一种新近发现的肿瘤转移抑制基因，目前研究认为其通过影响细胞骨架的改变迁移等而与肿瘤的侵袭转移相关联。该基因在肿瘤中的研究目前尚是新的领域，迄今为止国内外尚无有关于胃癌中的实验研究报道。本实验拟研究MTSSl在胃癌组织中多水平的表达情况及其与患者临床病理的相

2、关性，同时检测MTSSl杂合性缺失的情况，以明确在肿瘤进程中该基因失活可能的机制。并在此基础上深入研究MTSSl在体内外对胃癌细胞侵袭转移生物学行为的影响及其可能的机制。通过本课题的研究，可将MTSSl挖掘成为一种对于肿瘤的预后与转移具有指示作用的新兴标志物以及阻断胃癌转移的可能靶点。第一部分MTSSl在人胃癌组织中的表达与临床病理特征及预后的关系目的：研究MTSSl在人类胃癌中的表达情况及其与临床病理的相关性，以初步探讨MTSSl在人类胃癌中表达的生物学意义。方法：在包含胃癌癌旁正常粘膜、原发灶、淋巴结或其他转移灶的胃癌组织样本1072例的组织芯片中，利用

3、免疫组化、RT．PCR等实验技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测MTSSl的表达。并结合临床病理资料对实验结果统计分析，探寻MTSSl在人胃癌中表达的临床意义。结果i(1)胃癌组织及胃癌淋巴结或其他转移组织中MTSSl蛋白表达强度和表达率较癌旁正常粘膜组织中明显下降。MTSSl在胃癌原发灶组织中表达缺失率为70．1％(751／1072)，在胃癌淋巴结及其他转移灶中表达缺失率达88％(103／1171。RT．PCR、Westernblot中结果趋势也同上较一致。(2)MTSSl在胃癌中的表达与较多因素相关：随着肿瘤分化程度向低或未分化进展，MTSSl=的表达逐

4、渐减少，故与肿瘤分化程度相关(P<0．001)。另其与肿瘤大小(P=0．005)，肿瘤浸润深度，组织类型、淋巴结转移以及TNM分期均相关(P

5、在的判断预后有效指标。第二部分MTSSl在胃癌组织中表达缺失的相关机制研究目的：探讨肿瘤转移抑制候选基因(Metastasissuppressor1,MTSSl)在胃癌发生、发展以及侵袭转移中的可能的分子机制。方法：运用PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳．银染法对含癌旁正常粘膜、原发灶、淋巴结转移或转移灶的胃癌组织样本各13例MTSSl基因位点上4个微卫星位点(D8S1832、D8S2132、D8S1179、D8S1461)进行杂合性缺失(10ssofheterozygosity,LOH)检测。结果：在MTSSl表达阴性的胃癌原发及转移组织中LOH发生率较高，总LOH

6、率分别为46．15％和69．23％。结论：MTSSl基因位点频繁的杂合性缺失可能在胃癌的发生、发展以及侵袭转移中起到了一定的作用。第三部分转移抑制基因MTSSl在胃癌侵袭转移中的细胞学功能研究目的：应用定向基因克隆技术，构建MTSSl基因真核表达载体pEGFP．N1．MTSSl，建立并鉴定能稳定表达外源MTSSl基因的胃癌细胞系。通过基因双向表达调控以研究MTSSl基因对AGS和MGc80．3细胞生物学行为的影响及其可能的机理。方法：1、通过基因克隆技术获得人MTSSl基因cDNA序列，将其克隆至T载体，测序正确后，经酶切、回收并连接到真核细胞表达载体pEG

7、FP．N1，构建pEGFP．N1．MTSSl表达载体，经酶切鉴定、测序正确后，用脂质体转染技术将pEGFP．N1．MTSSl表达载体和设计合成的干扰序列ShRNA431分别转染人胃癌细胞株AGS和MGcS0．3细胞，根据绿色荧光蛋白的表达率确定转染效率，利用Realtime．PCR、免疫印迹法鉴定表达产物，紫外．可见分光光度法测定MTSSl活性的改变。2、以成功构建的分别能稳定表达外源pEGFP．N1．MTSSl，瞬转ShRNA431，空载体pEGFP．N1／对照NC的胃癌细胞系和未转染的AGS／MGc80．3细胞为研究对象，通过MTTlY,色、平板克隆集落

8、形成、transwelld,室侵袭迁移实验以及裸鼠体