tlr4及其信号通道在小鼠视神经损伤后的作用及机制研究

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1、第三军医大学博士学位论文TLR4及其信号通道在小鼠视神经损伤后的作用及机制研究姓名：郑政申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：叶剑2012-11第三军医大学博士学位论文TLR4及其信号通道在小鼠视神经损伤后的作用及机制研究摘要中枢神经系统损伤后的再生问题一直是医学研究的难点和热点问题，视神经作为中枢神经系统的一部分，由于其特殊的生理特性而成为中枢神经系统的代表。故探讨视神经损伤后的修复问题，不仅对视功能的恢复也对中枢神经系统疾病的治疗和中枢神经系统损伤后功能的恢复有着重要意义。目前视神经损伤后大量研究集中在如何促进神经细胞再生，抑制或去除抑制神经

2、细胞再生的不利因素，尽管取得了较大成就，但是对于损伤后神经的再生仍存在较多问题。大量研究表明，炎症反应在创伤性中枢神经损伤后的继发性脑损害过程中发挥重要作用。目前已发现多种细胞因子，如肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)、白介素一6(interleukin一6，IL一6)、化学因子、粘附分子等参与炎症过程，并加重神经损害。但迄今有关机理研究仍无突破性进展，尚不能给以有效地临床指导。且上述炎症分子均是其下游事件，据推测TLR4可能作为炎症反应网络中的急性炎症反应损伤的扳机点启动这种病理过程。近年来，随着对革兰氏阴性细菌的外膜

3、成分脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)弓I起器官组织严重炎症反应机理研究的深入，机体固有性免疫细胞(Ond,胶质细胞)表达的Toll样受体(Toll—likereceptors，TLRs)，在炎症反应中的作用和机理，引人关注。已有研究发现，LPS与TLR4特异结合，可激活TLR4，引起细胞活化，通过复杂的调控机理，引起下游多种细胞因子的产生和释放，导致炎症反应。中枢神经系统的固有性免疫功能，主要由小胶质细胞完成，而炎症因子的释放主要是通过TLR4--NF—rd3信号传导途径。随着深入研究，发现TLRs也出现在没有外源性病原体入侵

4、的情况，TLR4配体除了LPS之外，热休克蛋f刍(HSP60、70)，坏死细胞碎片等也是其配体。而神经外伤后，在轴突损伤周围也发现HSP60、70的出现。这一结果提示：和感染一样，外伤也可能通过某种机制，上调CNS小胶质细胞TLR4的表达，在创伤性视神经损伤后参与调控炎症反应。早于1988年Hashimot等在果蝇中发现了一类属于I型跨膜蛋白的受体，命名为5第三军医大学博士学位论文TLRs。TLRs是与果蝇Toll蛋白具有同源性的受体蛋白家族，不仅参与果蝇的胚胎发育过程，还在成年果蝇的免疫防御中发挥重要作用。1997年和1998年，Medazhit

5、ov和Rock等克隆出了另外一种Toll的同源物，即如今的TLR4蛋白。最初，TLRs介导的细胞应答一直被认为是促炎的宿主防御应答，主要是消灭入侵的病原体，包括中枢神经系统。然而研究发现TLRs也出现在没有外源性病原体入侵的情况，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)，多发性硬化症等神经变性疾病。TLRs在CNS中主要在小胶质细胞和星形胶质细胞表达，当小胶质细胞激活后，TLRs即迅速出现。而研究发现在视神经损伤后，小胶质细胞即被迅速激活。因此，当视神经损伤后，视网膜、视神经小胶质细胞TLR4的表达变化、意义，以及其引起炎症链

6、式瀑布反应的机理研究，对这一系列问题的探讨，对于进一步认识创伤性视神经损伤后视网膜及视神经继发性损害的发生机理，制定有效的诊断和治疗措施，有重要意义。现在认为，TLR4信号通道主要包括MyD88依赖和非依赖信号通道(TRIF通道)。而在神经损伤后，活化的TLR4具体通过哪一条信号通道传递，不得而知。有可能通过TLR4激活的两条信号通道在各自介导的炎症反应中发挥着独特的作用。以往的研究认为，核因子一v．B(nuclearfactor—r,B，NF一1(B)是调控炎症反应强弱的核心，它受各种物理及生化因子激活，诱导多种炎症因子和酶等基因的表达，介导瀑链

7、式炎症反应的形成、发展及恶化。TLR4是LPS受体，早期识别侵入体内的G一细菌并通过LPS—TLR4一NF．r．B信号传导途径启动炎症反应，目前倾向认为，TLR4--NF—v,zB信号传导途径，也是中枢神经系统一些病理状态的发病基础。那么，对于创伤性视神经损伤后，发生的炎症反应是否也主要通过TLR4一MyD88．NF一1(B信号传导途径启动，并产生炎症因子IL一6，TNF等，介导对视网膜、视神经的炎性损伤，尚未见报道。因此，本研究旨在围绕小胶质细胞TLR4表达变化、意义及信号通道对炎症的调控这一中心问题深入展开，并明确TLR4在视神经损伤后再生修复

8、中的作用。方法：本研究利用BALB／cd、鼠建立视神经损伤模型，通过免疫组化及westernblot实验证实TLR4在视神