中药活性成分在线色谱筛选新模型研究

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1、分类号：!!!!UDC：鱼!墨一羽擎JlAN13SUNIVERSITY密级：坌墅编号：!Q圣皇旦堡Q!!垒QQ皇博士学位论文论文题目：饿中药活性成分在线色谱筛选新模型研究作者姓名：指导教师：答辩日期：童珊珊余江南教授2012年12月23日分类号UDCR917615密级编号—10299B—0714009中药活性成分在线色谱筛选新模型研究ScreeningoftheActiveComponentsfromTraditionalChineseMedicineUsingOnlineChromatographySystem论文答辩日期：2Q12=12=232012年11月学位

2、论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在年解密后适用本授权书。不保密论文作者签名：龟树耐指导教师签名：aop年I≯月≯f日沙fv年l1，月文／日独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经

3、发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：谨戤谢日期：沙I≯年I乙月√日本论文获以下项目资助1．2009年度国家自然科学基金项目名称：TrkA脂筏色谱及其在中药抗肿瘤活性成分筛选中的应用项目编号：309736772．2011年度教育部博士点基金项目名称：脂筏色谱模型的建立及其生物亲合特性研究项目编号：201132271100123．2011年度江苏省“六大人才高峰”第八批高层次人才项目项目名称：中药抗肿瘤活性成分高通量筛选新方法研究项目编号：2011-YY012

4、4．2008年度江苏省高校自然科学基金项目名称：水飞蓟抗氧化活性成分的在线筛选及药效学评价研究项目编号：08KJB360001江苏大学博士学位论文摘要中药活性物质是指中药及其复方中发挥作用的化学成分，它是阐明中药作用奥秘的关键。由于中药作用的整体性、中药成分和作用机制的复杂性，使得中药效应物质基础的阐明一直进展缓慢。寻找适于中药复杂体系效应物质基础的研究方法，进而建立科学的质量控制方法，一直是中药研究的关键科学问题。长期以来，国内中药活性物质基础研究的主流模式是在化学成分提取、分离和结构鉴定的基础上利用药理模型对所得的纯化合物进行生物活性测试。多年来，这种研究方法阐

5、明了一些中药的效应物质基础。但是，常规的提取分离手段只能分析中药的主要特征性成分，而不能评价这些成分是否具有活性。本论文的研究目的是构建不同层次的中药药效物质基础的在线筛选色谱模型，并以各类提取物的抗氧化或细胞毒性指标的测定结果进行验证，使效应成分的分离与筛选相结合，克服以往先从中药中分离单体或部位，再分析其药效，致使成分分离与效应筛选脱节的弊端。主要研究工作如下：1．构建抗肿瘤药物的脂筏色谱在线筛选模型并研究其热力学机理，将由U251细胞提取的脂筏固化于硅胶载体上制备酪氨酸蛋白激酶受体(TrkA)．脂筏色谱柱，进行色谱保留特性研究。由于构建的脂筏．硅胶固定相富含Y

6、rkA，固定相能与以TrkA为靶点的药物特异性结合产生保留，而非TrkA靶点的药物在该脂筏色谱柱中无保留行为。经不同时间和不同流动相的使用，证明TrkA．脂筏固定相色谱系统稳定，使用寿命长。首次进行脂筏色谱的机理研究，以TrkA为靶点的药物来他替尼为例，考察了脂筏色谱柱填料粒径、温度、流速对色谱行为的移Itr．．,"。I，探讨了溶质在固定相和流动相之间的迁移焓变、迁移熵变等热力学参数的变化。结果发现适宜的填料粒径有利于来他替尼在脂筏色谱上的保留及分离；在中药活性成分在线筛选色谱新模型研究柱温37℃，流速0．2ml／min的色谱条件下能得到较适宜的保留效果。对于来他替

7、尼而言，与脂筏固定相作用过程NZXIIo、／kSo均为负值，说明这种脂筏固定相的分离机理是氢键或范德华力等协同作用的结果。2．将构建的脂筏色谱系统应用于中药五倍子的抗肿瘤活性成分筛选，得到的在色谱柱上有保留行为的乙醚部分显示出良好的抑制u251肿瘤细胞毒性。为进一步证明这种柱上保留行为是TrkA与药物间结合力的结果，而非脂筏中其他蛋白的作用，我们在细胞试验的对照组中加入了低浓度的TrkA信号阻断剂，观察在TrkA脂筏柱上有保留的物质在细胞试验中饱和TrkA后，是否还能继续抑制U251细胞的增值。实验结果可见，脂筏色谱筛选出的具有明显保留行为的中药提取物与特异性T