京尼平交联羊膜的制备、体外性能及治疗角膜碱烧伤的实验研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文京尼平交联羊膜的制备、体外性能及治疗角膜碱烧伤的实验研究姓名：王岚申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：赵敏201205京尼平交联羊膜的制备、体外性能及治疗角膜碱烧伤的实验研究摘要目的：研制一种新型的脱细胞羊膜制品一京尼平交联羊膜，观察其生物物理性状及在体外的细胞相容性，并且进一步观察其有效性，通过对兔角膜急性碱烧伤治疗效果的观察，探讨其在修复眼表过程中发挥作用的机制，为该新型的生物材料的临床应用提供前期试验依据。本研究分为三部分：部分一：京尼平交联羊膜的制备部分二：京尼平交联羊膜的体外性能研究部分三：京

2、尼平交联羊膜治疗兔角膜急性碱烧伤的实验研究方法部分一：经一定程序将羊膜用0．5％、1％的京尼平溶液进行交联制得京尼平交联羊膜，在肉眼下观察大体外观、检测抗缝线撕裂能力、显微镜下观察细微结构，HE染色，扫描电镜观察。部分二：按照实验一的方法，分别随机选取制备好的新鲜及交联羊膜，按实验进行分组。每一组分别进行检测：1、厚度测定：滤纸吸干待检羊膜表面水分，用厚度仪(精度O．0l咖)夹住羊膜，适当地加压，读出指针读数22、力学性能测定：在生物材料拉力测试机上对各组样品羊膜进行单向拉伸，样品断裂时，计算机自动输出抗拉强度(Mpa)、断裂伸长

3、率(％)、弹性模量(Mpa)及应力一应变曲线等。3、降解率测定：将制备好的两种样品羊膜在室温下自然风干，并剪取同样大小的相等数量的两种羊膜数片，在固定的时间点分别称量其浸入胶原酶溶液前后的质量M。，M。，降解率=(M。-M。／M。)％，4、体外细胞毒性试验：将京尼平交联羊膜按一定面积容量比(1cm2／1m1)浸入细胞培养液中72h获取京尼平羊膜的浸提液，以该浸提液代替常用细胞培养液，以常用细胞培养液组作为对照，培养相同密度小鼠成纤维细胞，于培养的2、4、7天行MTT，计算RGR部分三：60只健康新西兰大白兔，均无眼部病变。以右眼造

4、碱烧伤模型(重度)后随机分成3组，每组20只。A组：烧伤后移植G—HAM。B组：烧伤后移植AM。C组：不做任何处理，对照组，仅滴眼药水。术后每天观察眼表大体状况，羊膜脱落时间。从第7天开始，每周观察术眼角膜混浊度和新生血管并对两者评分。同时取角膜HE染色。结果部分一：京尼平交联后的羊膜肉眼下见：外观呈淡蓝色半透明膜，镊子提起时较易成型，不易卷曲、撕裂，质地柔韧。电镜下可见交联后的羊膜胶原之间的联系更加致密，结构未改变。部分二：1、组织厚度测定结果显示，京尼平交联后的羊膜平均厚度(0．040±0．009)mm，新鲜羊膜平均厚度(O．

5、038±O．010r)衄，京尼平交3联羊膜略有增厚，但差异无统计学意义(p>0．05)2、两组羊膜生物力学性能测定结果：京尼平交联羊膜的最大应力、抗拉强度，断裂伸长率，弹性模量与新鲜脱细胞羊膜的最大应力、抗拉强度，断裂伸长率，弹性模量相比具有增加，且差异有统计学意义(p

6、4．08)％，Week2(34．93±6．07)％，Week3(50．49±4．77)％，Week4(74．62±3．81)％。4、京尼平交联羊膜体外细胞毒性：按照国标“GB／T16886．5—2003”的规定畸3，京尼平交联羊膜体外细胞毒性分级0～1级，无或低细胞毒性，符合生物材料要求。部分三：每只眼均为重度碱烧伤，总共参与实验兔眼54只，相应观察结果如下：1、京尼平交联羊膜完全溶解脱落的时间为20．00±10．418d，而普通羊膜为9．20±10．618d，差异有统计学意义(P<0．01)。2、术后14、28、42天，京尼平交

7、联羊膜组CNV评分与对照组比差异有统计学意义(P<0．01)，术后14、28、42天，普通羊膜组CNV评分与对照组差异无统计学意义(p>0．05)。3、术后14d，京尼平交联羊膜组与普通羊膜组角膜浑浊度评分与对照组差异均无统计学意义(p1>0．05，p2>0．05)；术后28、42d，4京尼平羊膜组与普通羊膜组角膜浑浊度评分与对照组相比差异均有统计学意义(P<0．O1)；而G—HAM组与AM组角膜浑浊度评分差异无统计学意义(P>0．05)4、在1个半月的观察期，分别有1只眼(AM组)和3只眼(control组)发生角膜穿孔，排出实

8、验。结论1、京尼平交联羊膜具有良好的生物力学特性，其柔韧性和可塑性优于单层羊膜，其在厚度没有增加的情况下，可延长在眼表的停留时间，并且没有细胞毒性。因此，京尼平交联羊膜是一种能克服传统羊膜所存在的缺点的新型生物材料。2、治疗角膜化学性碱烧伤，京尼平