若干中药组分对香烟烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病炎症反应的作用及机制研究

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1、复旦大学博士学位论文若干中药组分对香烟烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病炎症反应的作用及机制研究姓名：李璐璐申请学位级别：博士专业：中西医结合临床指导教师：董竞成2012-04-01博士学位论文中文摘要若干中药组分对香烟烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病炎症反应的作用及机制研究中文摘要目的经过长期的科研及临床研究，我们发现补肾益气方药能够治疗气道等的炎症性疾病。中药经验方剂补肾益气方(淫羊藿、黄芪、生地)和补肾益气清热方(淫羊藿、黄芪、黄芩、生地)是本研究团队在诊疗哮喘、COPD等慢性呼系统炎症性疾病的过程中总结出的有效方剂，它对中医辨证为肾阳虚、肾气虚或肺肾两虚或兼痰热郁肺之侯的COPD和哮喘患

2、者有较好的疗效。我们对补肾组分淫羊藿苷和清热组分黄芩苷的前期实验已证实淫羊藿苷对抑制脂多糖、卵蛋白等诱导的炎症确切有效，黄芩苷对抑制香烟烟雾暴露诱导的炎症确切有效，黄芪甲苷、生地梓醇等也有实验证实对支气管炎、心肌炎、肝炎等炎症反应有良好的抑制作用。但国内外对淫羊藿苷、黄芩苷、黄芪甲苷和生地梓醇在香烟诱导产生的COPD炎症反应中作用如何及影响机制尚未有广泛研究。结合传统医学中淫羊藿、黄芪、黄芩及生地在治疗肺胀、咳嗽、喘证的重要作用以及本团队对补。肾益气方和补肾益气清热方的物质基础研究及确切临床疗效的认识，我们通过观察中药补肾组分淫羊藿苷、益气组分黄芪甲苷、清热组分黄芩苷和滋肾组分生地梓醇

3、对香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎症反应的作用，探索中药有效组、黄芪甲苷、黄芩苷和生地梓醇抑制CS所致的炎症反应的部分分子机制。方法1．建立香烟烟雾(CS)诱导的小鼠COPD炎症反应模型，并采用中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芩苷、生地梓醇和补肾益气组分方(淫羊藿苷、黄芪甲苷和生地梓醇合方)进行干预。随机将小鼠分为18组，每组10只，分别是正常对照组、COPD模型组、COPD+地塞米松组(1mg／kg)组、COPD+淫羊藿苷高、中、低剂量组(100、50、25mg／kg)、COPD+黄芪甲苷高、中、低剂量组(40、20、10mg／kg)、COPD+黄芩苷高、中、低剂量组(10

4、0、50、25mg／kg)、COPD+生地梓醇高、中、低剂量组(20、10、5mg／kg)、COPD+(淫羊藿苷+黄芪甲苷+生地梓醇)高、中、低剂量组。采用连续香烟烟雾暴露法建立小鼠COPD模型；测定小鼠实验开始前和实验结束时的体重：采用WBP全身体积描计仪检测各组小鼠肺功能；采用H&E染色制成病理切片在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织结构、炎症细胞浸润、病理学博士学位论文中文摘要评分、平均内衬间隔(MLI)、肺泡破坏指数(DI)；采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清及肺泡灌洗液(BALF)中IL．8、TNF．0c、MMP．9的水平；采用免疫组织化学染色检测各组小鼠肺组织组蛋白去

5、乙酰化酶2(HDAC2)和糖皮质激素受体(GR)表达：采用Westernblot法检测各组小鼠肺组织HDAC2蛋白及磷酸化的HDAC2蛋白、GR蛋白和NF．r,BP65蛋白、磷酸化的P65蛋白及Ir．B．a蛋白表达；采用HDAC2活性检测试剂盒检测各组小鼠肺组织HDAC2活性变化。2．建立香烟提取液(CSE)干预A549细胞诱导的炎症反应模型，并采用中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芩苷和生地梓醇进行干预。观察几种中药对CSE诱导的A549细胞炎症反应的作用时，细胞分组为：Control，CSE，CSE+淫羊藿苷(1、10、50uM)，CSE+黄芪甲苷(1、10、50laM)，CSE+黄芩

6、苷(1、10、501．tM)，CSE+生地梓醇(1、10、50laM)、CSE+地塞米松(1pM)。采用CCK．8试剂盒检测药物对细胞的增殖与毒性作用；采用ELISA检测细胞培养上清液中IL．6、IL．8和TNF．0c的水平；采用Westernblot法检测细胞HDAC2蛋白、GR蛋白和NF．1(BP65蛋白表达；采用HDAC2活性检测试剂盒检测细胞HDAC2活性变化；采用real．timePCR检测细胞HDAC2mRNA和GRmRNA表达。结果1．香烟烟雾暴露可明显减轻小鼠体重，损伤小鼠肺功能从而降低小鼠PEF、PIF及MV，导致小鼠肺组织炎症细胞浸润、肺组织结构改变及肺气肿发生，并

7、能显著升高小鼠血清及肺泡灌洗液中IL．8、TNF．0【和MMP．9水平，损伤小鼠肺组织HDAC2活性及蛋白表达，诱导HDAC2磷酸化，降低小鼠肺组织GR蛋白表达，增强P65磷酸化、降低11(B．0【表达从而激活NF．1cB信号通路(P