隐孢子虫lamp检测方法的建立与应用

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1、河南农业大学硕士学位论文隐孢子虫LAMP检测方法的建立与应用姓名：史亚东申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：菅复春201206河南农业大学2012届硕士研究生论文摘要隐孢子虫病(C∥ptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种重要的人兽共患寄生虫病，可以引起人及哺乳类、鸟类、鱼类、爬行类等动物出现腹泻或消化道症状，对Jj免疫缺陷或抑制病人危害更严重，甚至危及生命。随着【业化和城市化的快速进行，环境污染越米越严重，含有隐孢子虫卵囊的动物或人的粪便污染食物或饮水，存在人或动物感染隐孢子虫的风险，冈此需要更适合的检测方法对动物粪便或

2、环境样本进行检测。本研究的目的就在于建立一种简单、快速、特异性好、灵敏度高的分子生物学方法米检测粪便中的隐孢子虫。本研究根据微小隐孢子虫18SrRNA基冈的4条特异LAMP引物设计2条环引物，初步建立并优化了LAMP(环介导等温扩增)方法来快速检测微小隐孢子虫。结果发现，LAMP反应过程可省去95℃热变性和80。C酶火活过稗，最佳反应温度利时间分别是63℃利60min，MgS04、Betaine、dNTPMixture、BstDNA聚合酶的最佳浓度分别是8mmol／L、O．8mol／L、0．8mmol／L、8U／259L，外内引物最浓度分别为0．29mol／L、1．29mol

3、／L，添加环引物后LAMP反应时间缩短为20min。该方法展现了较好的特异性，检测微小隐孢子虫出现LAMP特征性梯状条带，对贾第虫、肠阿米巴、柔嫩艾美耳球虫、类圆线虫检测则无特征性梯状条带；LAMP的检测限度为5×100个／¨L，比常规PCR方法的检测限度低2个数量级(100倍)；LAMP产物经酶切验证得到预期的结果。比较LAMP产物在3个不同浓度琼脂糖中电泳，发现在1．5％的琼脂糖中电泳时，LAMP条带较分散，比较容易观测；比较4种不同的LAMP结果判断方法，发现通过SYBRGreenI显色米判断LAMP结果可川丁．现场快速检测。本研究对C．parvum、C．wrairi、

4、C．muris、C．baileyi和C．serpentis的一些18srRNA基冈序列进行比对，得到保守片段，利用该保守片段设计LAMP引物，建立并优化了隐孢子虫属特异可视LAMP检测方法。LAMP反应体系优化结果为：最佳反应温度利时间分别为63℃和60min，MgS04、dNTPMixture、Betaine、BstDNA聚合酶的最佳浓度分别是8mmol／L、】．0mmol／L、0．8mol／L、8U／259L，外内引物最浓度分别为O．21amol／L、1．6pmol／L，添加环引物后LAMP反应时间缩短为20rain。建立的LAMP方法检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、鼠隐

5、孢子虫、安氏隐孢子虫、隐孢子虫禽基冈型V出现LAMP特征性梯状条带，经SYBRGreenI显色为(亮)绿色，而贾第虫、肠阿米巴、柔嫩艾美尔球虫、类圆线虫及舣蒸水无特征性梯状条带，经SYBRGreenI显色为橙色；LAMP的检测限度是5×101个卵囊仙L，比常规PCR方法的检测限度低】个数量级(10倍)：LAMP产物经酶切验证得到了预期的结果。本研究对SYBRGreenI的使，H：

6、做了系统详细的优化，发现该染料的最佳使用浓度是1000×，最佳使用量是1山，最佳观测方法是可见光直接肉眼观测，我们还创新了一种染料添加方法，可以不开盖进行显色反应，该方法经济、实用，非常适合于LAM

7、P结果的可视判断；LAMP产物经SYBRGreenI显色的检测限度和电泳检测限度相似。对实验室保存的样本进行检测也验证了该方法的可行性，该方法的检测敏感性和巢式PCR方法的相似。第1页共60页河南农业大学2012届硕士研究生论文关键词：隐孢子虫；环介导等温扩增；聚合酶链式反应；检测；染色第2页共60页河南农业大学2012届硕士研究生论文EstablishmentandApplicationofLAMPforDetectionCrypsporidium⋯Supervisor：AssociateProfessorJianFuchunMasterCandidate：ShiYadon

8、gAbstract：CryptosporidiosisisanimportantzoonoticparasiticdiseasescausedbyCryptosporidium，andthemammals，birds，fish，reptilesandotheranimalscancausediarrheaordigestivetractsymptoms，itismoreseriousharmforpatientwithimmunedeficiencyorinhibition，evenhavelife·t