猪隐孢子虫病流行病学研究及隐孢子虫动物模型的建立

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安徽农业大学硕士学位论文猪隐孢子虫病流行病学研究及隐孢子虫动物模型的建立姓名：赵长城申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李培英;余为一2003.4.1 中文摘要隐孢子虫病是一种由隐孢子虫引起的呈世界性分布的人兽共患原虫病。该病给人类健康和动物生产带来严重危害，是人类艾滋病患者死亡的原因之一。迄今尚无预防和治疗本病的特效药物，为了摸清隐孢子虫病的流行特点和发生规律，本研究采用病原学和分子生物学方法对安徽省猪隐孢子虫病流行情况进行了调查。在此基础上，用所获猪源隐孢子虫卵囊建立了动物(小鼠)模型。首先，采用金胺酚一改良抗酸染色法和饱和白糖溶液漂浮法对安徽省l1个县、市739头猪隐孢子虫感染情况进行了调查。其总感染率分别为27．20％(201／739)和26．79％(198／739)，两者之间差异不显著(P>0．05)。对不同地区猪隐孢子虫感染率间差异性进行比较，淮北地区猪隐孢子虫感染率极显著地高于江淮之间和皖南山区(P<0．01)，江淮之间和皖南山区猪隐孢子虫感染率间差异显著(P<0．05)；对不同年龄段猪隐孢子虫感染率间差异性进行比较，4月龄以内(含4月龄)猪隐孢子虫感染率极显著地高于4～8月龄(含8月龄)和8月龄以上两个年龄段(P<0．01)，而4～8月龄(含8月龄)和8月龄以上猪隐孢子虫感染率间差异不显著(P>0．05)；公猪和母猪隐孢子虫感染率间无显著性差异(P>0．05)。调研数据处理结果表明，安徽省猪的隐孢子虫感染存在地区性和年龄差异，但与性别无关。分别对金胺酚一改良抗酸染色法和饱和白糖溶液漂浮法检获的隐孢子虫卵囊进行形态学鉴定，所获虫体为鼠隐孢子虫(CFyptosporidiummuris)和小隐孢子虫(Cryptosporidiumparrum)。从猪体内分离出￡muris和fpSFVU用在安徽尚属首次。其次，从上述739头猪的粪样中取148份，应用PCR方法进行检测。根据隐孢子虫SrDNA的基因序列，合成隐孢子虫属特异性引物。采用蔗糖溶液漂浮浓缩卵囊、液氮冻融裂解虫体的方法制备模板DNA，与隐孢子虫属特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增出540bp的片段。共检出阳性粪样47份，阳性率为31．76％(47／148)。首次从分子水平证实安徽省猪体内存在隐孢子虫病原。经金胺酚一改良抗酸染色法及饱和白糖溶液漂浮法判为阳性的猪粪样，PCR方法亦为阳性，阳性符合率为100％。在采用金胺酚一改良抗酸染色法判为阴性的1lO头猪粪样中，有9份经PCR方法判为阳性，说明PCR方法比病原学方法敏感性高，可用于感染强度较低的猪粪样中隐孢子虫卵囊的检测。免疫功能低下者对隐孢子虫特别易感。本研究还采用免疫抑制药 物(地塞米松)降低动物免疫功能的方法，利用小鼠建立了隐孢子虫感染的动物模型。先用地塞米松(DEX)对小鼠进行最佳免疫抑制剂量和时间筛选试验，得出20日龄昆明系小鼠以1．0rag／100mLDEX剂量连续饮水5天效果最佳。再用猪源隐孢子虫(从病原学方法检测感染强度较高的猪体内分离)￡muris和￡parvum卵囊(各1．75×106个)分别经口接种于处于免疫抑制状态的小鼠体内。免疫抑制接种组小鼠从接种后第2天开始从粪便中排出少量卵囊，以后逐渐增多，分别至第7天(￡parvum)和第8天(DmuriS)进入排卵囊高峰期，小鼠排卵囊呈明显的间歇性，每隔1～2天为一个高峰期，￡pa：vum感染小鼠两次排出卵囊高峰期之间间歇的时间比￡IllU-riS感染小鼠的短，进入排卵囊高峰期比￡muris感染小鼠早，临床症状、病理变化比￡flluris感染小鼠明显。经鉴定，免疫抑制接种组小鼠粪便中排出的隐孢子虫卵囊与接种的卵囊为同种隐孢子虫。而人工接种的￡murYs和￡parVUIII未在非免疫抑制接种组小鼠体内定殖。表明猪源隐孢子虫只有在免疫抑制状态下才能在小鼠体内定殖并完成其整个发育过程。综上所述，安徽省猪隐孢予虫分布广泛，4月龄以内(含4月龄)猪隐孢子虫感染率较高，猪体内存在Dmuris和￡pa_rvuln两种隐孢子虫，猪源￡muris和￡parvum可以感染小鼠。本文流行病学研究结果为安徽省猪隐孢子虫病的防治提供了理论依据；所建立的猪源隐孢子虫动物模型为今后隐孢子虫的体外培养、生物化学、免疫学、致病机理及该病的治疗等方面的研究奠定了基础。关键词猪隐孢子虫隐孢子虫病流行病学动物模型 AbstraetCryptospridiosisisaworldwideanthropozoonosiswhichhasseverelydoneharmtohumanhealthandanimalproductionandbeenrecognizedasoneofthecausesofmortalityinassociationwiththeacquiredimmunodeficiencysyndrome(AIDS)．ThepathogenistheprozotoanparasiteCryptosporidium．NoeffectivemedicationtopreventionandtreatmentofCryptospridiosisispresentlyavailable．Toascertaintheprevalentcharacteristicsandtheoccurrentregulation，theinvestigationsontheprevalenceofCryptospridiosisinswineswereexaminedbybothetiologicalandmolecularbiologicaldiagnosesinAnhuiprovince．AnanimalmodelwasestablishedwithCryptosporidiumoocystsobtainedfromthefe：cesofswinesbaseduponthem．Firstly，theprevalenceofCryptosporidiuminfectioninswineswasdeterminedrespectivelybybothauramine—phenolandacid-fast-staining(AP．AFS)andsaturatedwhitesugarfloation(noation)in1counties／cities．Anhuiprovince．ThetotalinfectiverateofCryptosporidiumwas27．20％(201／739)byAP·AFSand26．79％(198／739)byfloation．Thereisnosignificantdifferencebetweenthem(P>O．05)．WehadcomparedthediscrepancyoftheinfectiverateofCryptosporidiuminswinesinvariousareas．TheconclusionindicatedthattherateoftheNorthernareaoftheHuaiheRiverwasmorehigherthanthalofotherareasfP<0．01)andthatoftheareabetweentheHuaiheRiverandYangtzeRiverwashigherthanthatoftheSouthernareaoftheYangtzeRiverinAnhuiprovince(PO．05)．Nosignificantdifferencewasfoundinthatofbetweenmaleandfemaleswines．TheresultsshowedthattherewasdifferentintherateofswineinfectedbyCryptosporidiumbetweenagesandareas，butnorelationtothesex．TheCryptosporidiumoocystswereidentifiedmorph0109icallyasCryptosporidiummurisandCryptosporidiumparvumanditisthefirsttimethattheoocystswereisolatedfromswinefecesinAnhuiprovince． Secondly．polymerasechainreaction(PCR)wasappliedindetecting148ofabove—mentioned739samples．AsetofspecialprimerstOCryptosporidiumweresynthesizedbasedonthesequenceofsrDNA．ThetemplateforPCRwaspreparedwithconcentratingtheoocystsinswinefecesbySheather’Sfloationandfracturingbyfreezinginliquidnitrogen．Aspecialfragmentof540bpwasamplifiedandthepositiveratewas3I．76％(47／148)byPCR．ItisthefirsttimethatCryptosporidialinfectionofSwineswasconfirmedatmolecularlevelsinAnhuiprovince．ThepositivesamplesconfirmedbyAP·AFSandfioationwerealsopositivebyPCR．PCRprovided100％detectionefficiency．9of10negativefecessamplesdeterminedbyAP．AFSweredeterminedaspositivebyPCR．ThoseresultsindicatedthatPCRwasmoresensitivefordiagnosisofCryptosporidiosisinswinethanthatofetiologicalmethodsandmightbeappliedinthemicrodetectionofswinefecaloocysts．Inthisstudy，ananimalmodelofcryptosporidialinfectioninmousewasalsoestablishedbyusingtheDexamethasone(DEX)asaimmunosuppressanttodecreasecryptosporidialinfectioninimmunocompromisedpatientCryptosporidium．theanimalimmunocompetencetoviewOfthefactthattheisparticularlysusceptibletoAboveofall，thescreeningtestoftheoptimumimmunodepressiondoseandschedulewascarriedoutbyusingtheDEXimmunosuppressedmouseasalaboratoryanimalmodelforCryptosporidiosisandtheoptimumparametersforthismodelweretwenty—dayoldKunminglinemicethatwereimmunosuppressedbydailyDEX(1．0mg／100mE)providedindrinkingwater．Immunosuppressionshouldbeginbefore5days．Following，micewereinoculatedorallywithC．murisandC．parvumobtainedfromthehigherdegreeswinesfecesbyetiologicalmethod(1．75×10。oocysts／mouse．respectively)．Micebothinoculatedandimmunosuppressedbegansheddingsmallnumbersofoocystsonday2postinfection(PI)，thenrosegradually．Themicereachedthefirstsummitoffecaloocystsonday7PI(C．parvum)and8PI(C．muris)，respectively．Oocystswereshedintermittently，andthenumberofoocystshadariseeveryotherortwodays．TheintervaloftWOsummitsofinoculatedC．parvummicesheddingoocystswasshorterthanthatofinoculated C．埘“rfsmice．Asfarastheformerwasconcerned，thedateofthefirstsummitoccurringwasearlierthanthatofthelatter．UnlikeinoculatedCmurismice，theclinicalsymptomandpathologicalchangeofinoculatedC．parvllmmiceweremoredistinct．TheidentificationconductedontheCt—yptosporidiumoocystssheddingbymicewasthesameasthatoftheoocystsinoculated．CryptosporidiumCOlonizationwasnotobservedinthegroupwhichwasinoculated，butnotimmunodepressed．Theresultsshowedthatswine．derivedCryptosporidiumcancolonizeandfinishitslifecycleifsufficientlyimmunosuppressedInconclusion，CryptosporidiuminswinesdistributedwidelyinAnhuiprovinceandthepathogenwasmoreprevalentin≤4-monthagesSV*ines．TherearetwoCryptosporidiumspecies，namelyC．murisandCparvum．Inthisstudy，theresultsofepidemiogicalinvestigationonswineCryptosporidiosiswouldprovidethetheoreticalfoundationaboutbothpreventionandtreatmentandtheestablishedanimalmodelofCrypfosporidnlminfectioninmousewouldbethebasisofstudyoncellcultureinvitro，biochemical，immunoligical，pathopoiesismechanismandtreatmentresearches，etc．KeywordsswineCryptosporidiumCryptosporidiosisepidemiologymousemodel 引言隐孢子虫病(Cryptosporidisis)是一种由隐孢子虫引起的呈世界性分布的人畜共患寄生虫病。隐孢子虫(Cryptosporidium)能广泛感染人和多种脊椎动物，引起人和哺乳动物的严重腹泻¨J，及随之而来的脱水、虚弱，乃至死亡。尤其对免疫缺陷、免疫损伤和免疫抑制的人和动物，死亡率更高，已被公认为人和动物腹泻的重要病原¨1。隐孢子虫在艾滋病(AIDS)病人中的感染率可高达48％，是人类艾滋病患者的主要致死因素之一[3-51。它严重威胁人类健康和畜牧业生产。长期以来，隐孢子虫病被认为是一种无症状感染而未受重视，直到1993年，美国由于发生了水源污染而导致人隐孢子虫病暴发，造成四十多万人发病16J后才引起人们的关注。近年来，国外对隐孢子虫研究较多，国内的研究才刚刚起步。从动物种类来看，国内外多是以人、牛和鸡为主，猪隐孢子虫病研究仅有零星记载，而安徽省至今尚未见从猪体内分离出隐孢子虫的报道。随着人民生活水平的提高，人和畜禽流动的范围和频率逐年增加，造成隐孢子虫病有蔓延的趋势。安徽省是农业大省，养猪业的收入至今仍是广大农民群众的主要经济来源，养殖水平高低直接关系着本省经济发展和人民生活水平的提高。隐孢子虫感染猪体形偏瘦，粪便稀软甚至水泻，年龄越小症状越明显，如与其它病原体混合感染则症状更加严重，影响了猪的增重速度，甚至有些仔猪因腹泻衰竭而死亡，造成很大的经济损失，挫伤了广大人民养猪的积极性，严重制约了我省养猪业的发展。本课题旨在通过对安徽省猪隐孢子虫病流行病学研究，摸清安徽省猪隐孢子虫病病原种类及分布特点，为该病的防治提供理论依据。隐孢子虫对外界各种因素有很强的抵抗力，常用的化学药物对它无显著的抑杀作用，虽然国内外学者已在隐孢子虫分类、生活史、免疫学及疾病诊断等方面做了大量的工作，并取得许多重要成果，但隐孢子虫的致病机理还不清楚，隐孢子虫病的治疗仍是目前尚未解决的世界性难题。最大的瓶颈是缺乏用于生化研究和对可能的抗隐孢子虫化学治疗药物进行系统评价的动物模型，局限了对隐孢子虫病的深入研究。本课题拟在对猪隐孢子虫病流行病学研究的基础上，用所获猪源隐孢子虫卵囊建立动物模型，为隐孢子虫致病机理及隐孢子虫病治疗等方面的研究奠定基础。 文献综述隐孢子虫病(Cryptosporidisis)是一种由隐孢子虫((’ryptDspOridium)引起的呈世界性分布的人畜共患原虫病，该病给畜牧业生产造成严重的经济损失[7，81以及威胁免疫功能缺陷者的生命安全【9，10】。是艾滋病患者的主要致死因素之一。隐孢子虫最早由Tyzzer(1907)在小鼠胃腺组织内发现并命名【111，但由于感染小鼠没有症状，因而他认为隐孢子虫是非致病性原虫。直到1955年报道首例动物隐孢子虫病和1976年首次报道隐孢子虫引起人发病【l21，才引起人们的关注。近年来，因其通过水源、食源性传播引起隐孢子虫病暴发，给公共卫生、食品安全及安全供水带来极大的挑战[13。”】，日益受到国内外医学界和兽医学界的重视。1病原1．1分类隐孢子虫在分类上属于复顶亚门，孢子虫纲，球虫亚纲，真球虫目，艾美尔亚目，隐孢科，隐孢属【l引。目前隐孢子虫种的划分十分混乱，报道的隐孢子虫有20余种【l⋯，公认的为8个有效种【171，即寄生于哺乳动物的隐孢子虫有两个种：鼠隐孢子虫(Cmuris)，寄生于胃内，呈椭圆形，虫体大小为7．4um×5．9Ilm；小隐孢子虫(C．parvum)，寄生于小肠内，呈圆形，虫体大小为3¨m～5“m。寄生于禽类的隐孢子虫有2个种：贝氏隐孢子虫(C．baileyi)，寄生于法氏囊、泄殖腔和呼吸道，虫体大小为6．3肛m×5．1肛m；火鸡隐孢子虫(C．meleagridis)，寄生于肠道，虫体大小为4．7Hm×3．9“m：寄生于爬行类的C．serpentis；寄生于鱼类的C．nasorum；寄生于猫的C．庙，fs以及寄生于翥鼠的C．wrairi。张龙现等(2002)¨81把隐孢子虫分为安氏隐孢子虫(Candersoni)和贝氏隐孢予虫(c．baileyi)两个种。XiaoLH(1999)[”j将隐孢子虫种划为2个基因群：一群包括C．muris和C．serpentis；另一群包括C．baileyi、C．felis、C．meleagridis，C．wrairi和C．parvum。PerzJFetal(2001)120]从纽约州南郊3个地区的111份野生动物粪样中检测出22份粪样呈阳性，应用Southernblotting对其SSUPCR产物进行检测，鉴定为C．parvum，2份为基因型2，其余的属于2个新型SSU序列群，命名为基因型3和4；等等。这些分类上的不统一，可能存在同种异名 的现象，给实际工作带涞不便。随着生物技术的发展，现代分子生物技术具有传统形态学及生物讫学【2’1分类方滚无可魄耘豹俊趣往，已瘗麓予戆熬子虫分类掌磺究，可从遗传分子水平阐明该虫的种系发生关系，从而进行更精确的分类。嚣戆这方嚣己取缛了重大进展[22．231。Morganetal(1996)￡24l找到了戆斑予虫的特异性基因片段，可崴接区分人源、动物源隐孢予虫虫种e田宗戏等(2002)t25l克隆了我国C．parvum种特舅性基阁片段势对诊断引物进行了确定，该序歹6徽可能成为隐獭子虫分类鉴态的新依据，弗可依据该序列合成C．parvum种特弹性诊断引物熙于临床。1．2生浠史豫豫子虫农体内斡发育i26l一毅缀过裘疆生殖、配子生蓬帮穗子生殖三个阶段，这三个阶段都是在同～个宿主体内进行的，不需中间宿主，箨蠢接发窘罄。整个生遗史终霉5～ll天宠戒12’1。裂殖生殖孢予化卵囊进入体内(哺乳动物经口感染)聪，由于温度熬佟零露镬其蠹部豹予施子涟力增强，引起子孢予的运动帮位薰移动，卵囊壁上的裂缝扩大，子孢予郎从裂缝中锚出。脱囊后的子孢子很活跃，以其头端与宿主粘膜上皮细胞表面相接触盾，逐步发育为球形的滋养体，后经2～3次核分裂发育为3代裂殖体，成熟的i、3代裂殖体含有8个裂殖子。成熟的2代裂磺体含有4个裂殖子。配予生麓裂猿子避一步发骞为耀鬻子体稻雄酝予体，耀配子体呈癸圆形，雄配子体星不规则长椭圆形。成熟的雄配子体含肖16个子弹形豹雄配予霉瑟l令大残傣，雄酝子无鞭毛。髅罐配予体在臻主糕膜上皮细胞表面的带虫空泡中结合形成合予。合予外层形成囊爨后即发育为熨囊。孢子生殖在宿主体内可产生两种不同类型的卵囊，即薄壁卵囊和厚璧卵囊。薄壁卵囊占20％，在宿主体内可囊行脱囊，子獭子逸如后直接侵入宿主上皮细胞并继续发育繁藏，而使宿主蘸复感染，从而造成宿主的自体循环感染BsJ；厚黢卵囊占80％，在宿燕细胞内孢子化。孢予亿的卵囊陡粪便摊至矫界，污染周围环浚，造成个体阕静裙互感染。2流{亍瘸学2．1感染情况隐稳子虫鬃毽赛设分布，在溪大翻亚、美国、中南美湃、驻溯、非洲和欧洲均有隐孢予虫病流行‘291。1％～2％的艾滋病患者的死亡是 由隐孢子虫感染造成的130l，简危人群如婴幼儿、免疫功能抑制者，免疫功能缺陷者的感染率高达l5％～49％1311。据搬道Ij“，国外发展中戮家和发达国家腹泻瘸人中感染率分剐为4％～20％和O+6％～20％。我国腹泻病人中感染率为1．4％～13，3％[331，目前已知隐孢子虫可感染嗪巍缀7令磊，鸟缀霹令鏊，蕤行缁1个鼹及鱼缎2个餐等多荦事温盘和冷血动物13“，已被视为全世界腹泻病中6种最常见的瘸因之～。人与入之耀筵撵靛瘸镶，多冤予家庭成员、瞧饮斧、医陵痪入帮王作人员等。从动物佟给人的共患性传播的多数病例是出看护宠物或农畜尤其是奶牛|l孽铜莠人员、兽医，处理动魏分蒜物静学生、掰究人昃疆尔识可感染【3”。～般农村儿童隐孢子皮感染滩明显篙于城市儿童，这可能与农树的卫生条件较差，并经常与动物接触有密切关系。隐獭子虫可以感染从热带到温带的170多种渤物，其中包耩79种不问的哺乳动物¨】，根据与人类生活活动的密切稷度，下面就牛、猪萃瓣天隐稳子蛊黎染情况资辩分剐进行综述：Pancieraelal(1971)报道了全球首例牛隐孢子虫病【36】。1985年鼹圣文等1wj最先在国肉壤遂了牛隐爨子虫痪。据擞遭珏81，由瑟遂疾病致死的牛中，30％是凼隐孢子虫感染造成的，目前已知隐孢子融在犊警中豹感染率褪当普遍窝严羹，绘棼牛塑造藏较大赘经漭揍失。奶牛随餐生活水平的提高，人们对备类奶制品的消费量大幅度增加，奶牛感染隐孢予虫与落，与人类的健康息怒楣关，艨以器量学者对奶牛的隐孢子虫感染研究较多。国内安徽、黑龙江、河南、宁夏、北京、郑州、南京、湖南、济南、长春和广州等雾个省、市和地区已对奶牛隐褥子交懑染情况迸行了调焱，陌·陵率在5．3％～40％之阔，谲鸯发现，我国奶牛隐孢子虫瘸的病原体有两种：C，parvum和C．muris，投少数秀混合慧染，懿C．muris兔饶势耱。李培英等({999)f39l道过对26头自然感染隐孢子嫩奶牛的卵囊排出情况作了连续21个月的观察，对爨穗予虫感染奶牛熬舞囊撵出羧镣进行了探索，发褒巍然感染戆孢予虫奶牛多为持续排卵囊，转阴率极低。蒋金书锋(1989)f40l通过对北京地区牛隐孢予虫病的调查，证骥了牛隐豫子虫不其有臻主特磐性，它既能感染牛，也能感染小鼠，还诞明了牛隐孢子虫具肖一定的致病性。刘毅等(1994)t41l也富类似的报道。黄牛李谤英等(1998)i421、(1999)t43’分剐对露徽灵熬、滔搽、阜阳等黄牛隐孢予虫的感染情况进行了调查，结果袭明黄牛隐孢予虫感染存在年龄稻戆区性蓑异，餐与往澍茏关。2年戳肉黄牛鑫孽感染率磅显高于2年以上的黄牛，但2年以上黄牛的感染强度较高。严糟峰等(2002)婵q认巍教养字数戆染强发较群养孛懿鑫。此羚，云南省隧躜缝 嚣f嘲、江苏省徐鲻遗涎[461也鸯黄牛感染隐掇予虫靛摄道。国内黄字辫孢子虫感染率为27．3％～60．19％，C，parvum为黄牛隐孢予虫病的主要痪骧落。ScottCA8，alfl995)[471报道某个农场在过去5年内出生的犊牛80％以上滋录露漶豫予虫装黢泻，在553头鞠显撼袋成年牛串，粪便涂片检测62．4％牛C．parvum阳性，糖漂浮检测，92％样品阳性；KanetaYetatfl998)[431从圈本菜屠宰场收集的512份成年奶牛粪榉中捡如24份粪样呈鼯性，阳性率为4．7％(24／512)。法霞NaciriMeta1(1999)一叫调查一牛场，平均6日龄犊牛313头，其中sO％排C．parvum卵囊。3～7天看上舞裂84％～86％。SischoWMetat(2000)150l对荚鋈东就帮l{个奶牛场隐孢予虫感染情况进行了调查，结果在10个奶牛场检出了隐穗子壹鳃囊，英中15％犊牛(e～3蕊龄)粪镬中含有狳稳子塞辩囊，并对奶牛场污水进行了检测，调查结果阳性率为9％。可以看出，牛黪毽子盎鲢分布较受普遮，且塞种隧蟪区、牛豹品种等不闹而有所不同，奶牛主臻感潦C．muris，黄牛主要感染C．parvum，毽褒网一条{孛下，虫攀枣不圜警豹年龄蔼改嶷，这种差异一方西漩琨牛的隐孢子虫存在不同的种，嚣一方霹说骥不同蛾隧牛隐孢子虫优势稀资所不网。此外，不问地区隐孢子墩的感染率不阉，存在地区憔差异，这可髓与当遮串群静营养承平、孛场卫生条{孛及调查者采焉豹诊断方法不同有关。从资料中还可以看出，粪检阳性牛熙有少数表现出腹泻癍获，大多数仅爻亚妊床戆憋孢子虫感染，这霹缝是囱予它锻蕊免疫状况仍然正常或轻微低下，或者是感染程魔较轻的原因。猿罄内仅北京、濑南、云南、江苏、潺京和宁夏等乡数餐枣熬部分地区对猪隐孢子嫩感染情况进行了调壹，阳性率在4．2％～47．9％之闽，猿甄霹感染C，parvum瞧可感染￡muris，越毅等f1993)[引】摄道不同品种猪都可感染隐孢予虫，张忿现等f1998)[52l通过对郑州市郊8个猪场焚n3份粪样进行了隐孢予虫卵囊的检测，结果发现猪酶孢予虫感染率较高，但感染强度较低。李学懿等(1993)}”】还对猪隐孢子蠢感染与僵猪的形成、黄自痢的发生之间的联系进行了讨论。Viltacortoletat(1991∥4l采焉Ritchie，S方法、最终沉淀黪援藏绞戏甲蓝染料处理或用Koster法染色，对加利西豫地区2月龄阱内329头箨猪进行跨稳子虫黪染情况调查，结粟嚣检测瀣一窝10头50目龄无临床雅状的仔猪感染了隐獭子虫。IzumiyamaSetal(2001)【55l采用乙簸乙醚浓集法帮免疫荧光染篷法对爨本捧祭川县S个猪场232头断奶仔猪(1～3月龄)和252头育肥猜(6月龄)的粪样进行了调查，缩祭在4个猪场的77头(33．2％)款奶仔猪翻7头育肥猪粪样中捡出了6 隐孢子虫卵囊。Wieleretal(2001)f56】对德国南部的24个猪场有腹泻症状的205头乳猪和82头断奶仔猪进行了调查，结果在2个猪场中发现4头(1．4％)小猪感染了隐孢子虫。上述资料表明许多国家存在猪隐孢子虫的广泛感染，而且从资料分析可能存在不同种，并可初步看出猪的年龄越小，感染的机会越多。鼠体是隐孢子虫的重要保虫宿主，鼠隐孢子虫在鼠类中感染率较高，猪感染该虫种可能与鼠在猪圈周围活动频繁，猪食入受到鼠粪便污染的饲料有关。因此猪场应做好灭鼠工作。人隐孢子虫不仅是多种动物，而且也是人体的重要寄生性原虫。隐孢子虫可引起人致病，表现为急性胃肠道症状，多数患者水泻多日后转为慢性腹泻，免疫缺陷者可因感染隐孢子虫而导致死亡。国内自1987年韩范等1571首次在南京地区发现人体病例以来，有许多地区陆续报道发现了隐孢子虫，其感染率为5．29％～10．4％之间。赵雪妮等(1997)t58】对哈尔滨地区93l例不明原因腹泻的婴幼儿隐孢子虫感染情况进行调查，检出隐孢子虫卵囊l3例，感染率为1．39％。其中农村患儿隐孢子虫的感染率2．68％(11／421)明显高于城市患儿的感染率0．39％(2／510)；母乳喂养的患儿隐孢子虫感染率为0．24％(1／409)，明显低于人工喂养的患儿8．33％(9／108)。认为人乳可能有降低隐孢子虫感染的作用。陆绍红等(2000)133】对浙江省腹泻儿童隐孢子虫感染情况进行了分析研究，结果在548份腹泻儿童粪便中共发现57例阳性病人，隐孢子虫感染率为10．4％，男女之间感染率无显著性差异，其中l岁以下婴儿感染率为5．7％，而1～lO岁儿童的感染率为l7．5％，作者认为可能与1岁以下婴儿多为母乳喂养有关。EL．HoharyAHetal(1998)[59】在埃及Ghabia省采集180份有腹泻症状病人的粪样，检测结果隐孢子虫感染率为5．0％(9／180)，在44位隐孢予虫患者家属中有2位也感染了隐孢子虫。此外，还从与患者接触过的牛、狗、猫、绵羊、山羊、鸽子和鸡等粪便中检出隐孢子虫。SodemannMetalfl999)[60J对西非Guinea．Bissau地区的319例儿童的腹泻粪便进行了调查，结果感染率为5．53％。综合以上资料可以看出，隐孢子虫主要侵害婴幼儿，腹泻是本病的典型症状。至于被感染者表现出临床或亚临床症状，这要根据他们的体质状况以及食入感染期卵囊数量的多少而定。断奶儿童与母乳喂养阶段的儿童相比，母乳喂养阶段的婴幼儿感染率明显降低，这可能与母乳喂养能有效抵抗隐孢子虫感染和减少病原接触机会有关。此外，感染率的差异还可能与职业、文化程度、民族、生活条件及卫生习惯有关‘61l。 2．2感染来源病人(畜)秘带擞者是爨孢子斑瘸的主要感染来源，此外，出入翁舍的猫、狗、鼠及藻它野生动物也可能成为感染来源[62,631。FayerR口，al(1997)1641诞实海洋中的牲蛎可被C．parvum污染，并可传播隐孢予擞瘸；BullSAetal(1998)t65l对簌荑国Skomer岛诱捕的疆鬣进行了豫孢子虫感染情况调查，结果感染率为25％；LoweryCJetal(2001)t60‘驮癸尔法薪特海湾静潞永、污水中捡溺密隐建子墩，势在贝类中分离到隐孢予虫，证明隐孢子虫的确是食源性瘸原之～。此外，其他学者分爨簸缝表隶【6"、亵农168,691中捡溅如憋璁子虫。台湾鑫来拳厂瓣拳中隐孢子嫩范围在2．3～40个／100L[701，PaymentPetal(1999)plJ的试验证骥饮用水中残露豹氯不能杀延水中豹隐孢予虫，因此，隐孢予照给安愈供水带来极大的难题。2．3传攒途径本瘸的传播主要以粪一口途径为主[241。在病人、畜禽的粪便中含有丈耋}豹辩囊，会有拜囊鹣粪餐逶遥污染环境、钦农、食物等，经目遴入机体而使健康人和胬禽遭受感染[281，管瑕人员的衣服及手脚被污染，黪剐是携带被污染懿键粪爱粪迸爨筵它整会，鄹褥雩|莛零痍戆传播。隐孢子融感染和本病的发生与环境卫生条件和饲养管理水平有密切关系”乳”j。良好瓣环境卫生条传和镪葵蓉璞本乎对辫羝隐斑子虫感染极为重要；环境条件及卫生状况差是导致本病流行的主要原因之～。O‘Donopheetal(1995)IlJ报道人和牛之间隐孢子虫可互相传播，且是一萃申主要的流行瘸学因索，应注意牛粪的处理和牛奶的消海，避免牛粪浮染水源而引越人类感染。隐孢子虫也可通过公共用水和游泳池传播，该虫是承源疾瘸最重溪静致瘸原之～113l。承源污染可导羧隐稳子虫感染的暴发流行，1993年美国发生了经水传播的隐孢子虫病，40多万入发瘸，死亡100多久，弓|怒了垒球翡高度重褪[6t；1996年6箕基本的Saitame县暴发了因水源污染而引起的隐孢子融病，农总共14，000使羼爰中，8，800整爨民患痰，经济损失掺重173]。荚揍兰霸藏尔±从1992．1．1～1995．12．31共暴发了26怒传染性肠道痰病，麓中14起被怀疑为困隐孢子奴污染了公共用求和游泳池水所引起[131。鼗辨由于隐孢予虫卵囊较小，尘埃靛以携带其飞扬，便窟气飞沫传播成为可能134】。幽于隐獭子虫发育过程中产生薄壁型卵囊，因而可发生囊身感染128l。率虫可程家庭成员阉、母婺之闯交叉感染，少数耨JL所曾有流行倾向，感染率商达81．8％【741。 大量的交叉感染试验证实【7引，由一种动物体分离的隐孢子虫可感染同纲的其它种动物。绝大多数同源传播实验(哺乳动物·哺乳动物、鸟类一鸟类)取得成功，而异源传播绝大多数失败【76，771。人、哺乳类之间可相互感染，鸟类之间也可相互感染。已有多次报道饲养人员和兽医困和患病动物接触而发病【7引。LoweryCJetal(2001)"9j从39例北爱尔兰隐孢子虫病患者粪便中抽提隐孢子虫卵囊DNA，用PCR方法扩增TRAP．C2，测序结果87．2％病例的病原体是牛基因型2，其余病例的病原体为人基因型1。这表明最可能的传播方式是从动物传给人，而不是人．人之间的传播。2．4年龄和性别隐孢子虫的感染与人和畜禽的年龄有一定的相关性，一般说来，年龄越小，感染率及发病率越高且患病后症状越严重，死亡率越高。幼畜极易感染隐孢子虫，随着年龄的增长，家畜的免疫功能逐渐增强，其感染率和感染强度会降低[80,81】。性别不同的畜禽阳性率之间差异性不显著，即隐孢子虫的阳性检出率与性别无明显关系[421。张炳翔等(2002)[821对云南省6个地(州、市)所属7个县(市、区)的隐孢子虫感染情况进行了调查，结果发现，学龄前儿童的感染率最高，且男、女感染率无显著性别差异。2．5季节性多数学者认为隐孢子虫病多发于夏秋季节，陈有贵等(1993)报告每年的9～¨月份为发病高峰期【4“。Mclanehlineta／(2000)[93】用PCR．RFLP法对人和家畜的粪样进行了调查，结果表明隐孢子虫病有明显的地区性和季节性差异，不同地区暴发的隐孢子虫病，病原可能是不同种的隐孢子虫，进一步研究发现，不同季节暴发的隐孢子虫病，其病原基因型不同，只感染人的隐孢子虫基因型l多发于夏秋季节，而宿主广泛的隐孢子虫基因型2多发于春季。LefayDetal(2000)[34】则认为隐孢子虫病夏季感染率最低。张炳翔等(2000)t82】根据隐孢子虫分布较广，认为季节气候对其流行分布影响较小。各地高发季节不尽相同，其原因应进一步探讨。3致病作用隐孢子虫的致病作用与食入卵囊的数量与活力，机体免疫机能状态，宿主年龄等因素密切相关，其致病机理尚不清楚。可能是由于隐孢子虫引起肠绒毛表面凹陷、萎缩等病理变化破坏了小肠正常生理功9 能雨导致消化吸收障礴和腹泻等IS5l。轻度慧染可茏症状．严重戆染可致死亡。免疫功能正常者，腹泻具商自限憔，但免疫功能低下卷，不坟对隐穗子虫糁澍易戆，嚣嚣一量感染惹，薅情严重，i童往迂惩不惑，甚至危及生命1861。家套毖建孑虫瘗瀵茯蘩必3～7天。貉藤上圭簧表现为羧泻症状，相伴的众身症状可能有精神沉郁，厌食，粪便带有大量的纤维索，有黩含有敷滚。惑畜生长发育镣涝，极度消瘦，有对体温舞毫。瘸理剖梭的主要特征为空肠绒毛层葵缩和损伤，肠粘膜固有层中的淋熙细胞、浆细胞、蟥酸燃白细胞和巨瞧细胞增多，肠粘膜的酶活性较正常粘膜的低，譬典型的肠炎瘸交。隐孢子嫩感染对宿主的免疫器官产釜免疫抑制和缎织学损伤，势必导数机体的免疫功能下降，宿主对各种传染瘸的荔戆性增离。擎独感染ll雩死亡攀较低，交予瓣孢子受鬻作兔莛始蚀的条件致病因子，当与其他细菌、病毒、寄生斑等混合感染时，死亡率上秀。变长裣等f1999)l”l探讨了苦参鼹豫憨予蛊惑袋大惑缨魏免痰功能的影响，证实了隐孢予虫感染可降低宿主的免疫功能。有人认为，隐燕子虫寄生在人豢俸建，处予凝常条终下是不出现瘢状的。所检腹泻人荫的隐嘏子虫阳性检出率高，说明它们是由于受到了某种客观条件改变的影响(如蒋养失调、气候变化等)或与其它瘸原(如轮状瘸毒、大肠秆荣等)合并感染而发嫩的腹泻。4诊睃隐孢予虫病早期的实验察诊断对于检测疾病的发生和流行，降低廷￡：率露着重癸夔蕹臻及流行病学慧义，纛是本瘸茨治掺麓熬核心内容。隐懋子虫薅的诊撅是投攒瞧藤瘊凝、浚抒病学、癍理变化、盘凌学反应和虫体榆查而做出的。然而隐孢子虫的自然感染多呈隐。陡经过，感染者可以只囱终界排出卵囊，面不表现佼何临床症状，严重感染蠹篡症状也缺少特异性。因而确切的诊断只能依靠对隐孢子虫体内发育阶段的活体或歹E后剖输材料发粪便材料的实验室等段检查发现虫体和采用免痰学技术检测抗原挠体鲍方法13朝。邋年来，PCR技术的应餍极大地提高对携带者和慢性少巅排卵囊患者的检出率，且能区分隐孢子焱辩囊豹类型，签爱斑释，潮鼗萁来源，辩予控翱蒋染滚霖疾病静流行具有敷要的实用价值【髂】。4．1瘸漾学诊虢4，1．1组织学诊断lO 取相应的组织器官制成组织切片，按病原学方法进行取材，快速固疋和染色后，在宿主寄生部位可见到处于不同发育阶段的虫体及其内部结构，活体检测并结合光学或电子显微镜观察对研究隐孢子虫感染所引起宿主的组织病理和细胞结构变化有一定的应用价值。张敬伦等(1988)[891对广东省某鸡场的病鸡小肠和法氏囊的组织切片做病理组织学检查，在105只1日龄雏鸡中发现48只患病，检出率为45．71％。4．1．2粘膜涂片法在动物死前或死后尸体尚未发生自溶之前，刮取消化道或呼吸道粘膜，做成涂片，干燥、固定、染色，镜检。此法简便易行，诊断准确率高。张友三等(1991)【901取死牛肠粘膜刮取物作压片直接镜检和用蔗糖溶液漂浮法，对西安地区7个奶牛场722头牛，(其中犊牛565头，青年牛为48头，成年牛为109头)进行了隐孢子虫感染情况调查。结果其感染率：犊牛为75．40％，青年牛为6．25％，成年牛为29．36％；发病率分别为50．80％、0和27．52％。其中30目龄以内的犊牛感染率为81．54％～84．6l％，发病率为70．00％～79．50％；30日龄以上的犊牛上述指标逐渐下降。4．1．3粪便检查早期的病例都是通过组织活检发现虫体，1980年Tzipori【45|最早从人粪便中检测到卵囊，从此开始了无创伤性的诊断时代。粪便集卵法是用物理学方法浓集粪便中的卵囊，使卵囊浓度显著增加，从而便于在显微镜下观察的一种方法，可显著提高待检样品的检出率。主要适用于感染强度小、排卵囊量少的动物。该法在流行病学调查中具有一定的实用意义。已报道的主要有漂浮法和沉淀法两种。常用的漂浮法包括Sheather，s蔗糖漂浮法[91,92I、饱和白糖漂浮法【931、饱和硫酸锌漂浮法[45,94,95】、饱和硫酸镁漂浮法‘961等。隐孢子虫卵囊的浓集与漂浮液的种类及理化性质(如比重、浓度)有关，蒋金书等n992)[971比较了8种不同漂浮液对隐孢子虫卵囊的漂浮效果，认为比重为1．28的食用白糖溶液效果最好，在显微镜下视野清楚，杂质少，卵囊易于辨认。沉淀法主要有离心沉淀法、汞碘醛离心沉淀法、醛醚沉淀法等。根据操作简便、成本低、效果佳的原则，集卵主要采用漂浮法，沉淀法则很少采用。目前使用较多的是蔗(白)糖漂浮法。卵囊直接镜检常难以分辨，而染色后分辨率明显提高，染色法是目前应用最广泛的检测技术之一【9”。根据隐孢子虫卵囊在不同染液中的着色特点和内部的微细结构，依此与其它形态相似的物体相鉴别。取待检粪样涂片，干燥、固定、染色、镜检。目前常用于粪便涂片染色的方法有金胺酚一改良抗酸染色法[36,42,43,991、姬姆萨法【1o01、抗酸染 色法1101I、沙黄．美蓝染色法【m】、金胺一若丹明(Macpherson，1993)¨”‘、三色染色法(Garcia，1994)【104I、抗酸三色染色法(Ignatius，1997)o⋯’1等。张友三等(1993)t106l曾对改良抗酸染色法、Kectep染色法、Cross染色法、Giemsa染色法和负染色法等5种不同染色方法进行了比较，试验结果：抗酸和Giemsa染色方法较好，负染法可作为大量粪样检查时初筛标本使用。Macphcrsonetal[103】曾对Giemsa染色法、齐．尼氏染色法、金胺．酚染色法、Sheather’S漂浮法和间接免疫荧光试验以及改良糖液浓集漂浮法从检测闽值、成本、操作是否简便等多个方面对这6种诊断方法进行了比较。李超等(2003)‘∞‘71在温州地区患者的脑脊液采用改良抗酸染色法检测出患者颅脑部感染隐孢子虫。目前多采用金胺酚．改良抗酸染色法，这种方法使得所染卵囊与非特异性颗粒着色明显不同，卵囊着染为玫瑰红色，其它非特异性颗粒则染成蓝黑色：该法的优点是不具备荧光显微镜的实验室可用金胺．酚染色标本，接着用改良抗酸染色法复染，再用光学显微镜检查。其检出率和准确率有很大提高。目前，该方法被广泛用于隐孢子虫病的流行病学调查和诊断。现一般认为，要达到确诊应同时采用多种方法进行综合性诊断【3引。4．1．4动物接种主要用于进一步确诊经集卵法和染色法认为可疑的病例。方法是经口接种所收集的病料或提取物，给1～5日龄的初生实验动物口服接种物，接种后从第二天开始用染色法、漂浮法或免疫学方法逐日检查实验动物粪便，接种后第6天剖杀实验动物作病理学和肠粘膜抹片检查，以寻找虫体。可能会因宿主易感性不同而严重地干扰正确结论地得出[161。4．2免疫学诊断粪检方法存在费时、费力、检出率低和易出现非特异性染色以及镜检时易与酵母菌混淆等弊病，因此检查动物是否感染，除了在粪便或组织里发现病原体外，检测机体里是否存在特异性抗原和特异性抗体也是重要手段。目前应用的免疫学诊断方法主要有：ELISA、单克隆抗体直接免疫荧光反应、单克隆抗体或多克隆抗体间接免疫荧光反应、免疫印迹技术和反向被动血凝试验等。4．2．1酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验具有较高的特异性、敏感性和稳定性，操作简便且易于掌握，可检测粪便、血清、十二指肠液、胰液、胆汁、痰液等多种样品，对于恢复期患者、慢性期间歇排卵囊者、携带者具有重要的诊断意义。酶联免疫吸附试验适用于大规模流行病学调查与诊断。 目前已有多种ELISA试剂盒出售。Lappinef口，f1997)[1081以可溶性卵囊抗原和过氧化酶标记抗猫IgG为：二抗建立间接ELISA检测猫血清中的IgG的方法。黄克和等(1999)11o91、何宏轩等(2003)【¨01分别建立并应用间接ELISA检测动物血清中隐孢子虫抗体的方法，试验证明，该法具有快速、简便、特异和重复性好等优点。张西臣等(1996)t¨1】建立了应用双抗夹心-ELISA检测兔粪便中隐孢子虫卵囊抗原的方法，并对20头份兔粪便样本分别进行抗酸染色和双抗夹心．ELISA试验，结果抗酸染色法8份有隐孢子虫卵囊，而ELISA法除对抗酸染色阳性的8份粪样判为阳性外，还对抗酸染色阴性的1份粪样判为阳性，且不与兔球虫粪便发生类属反应。尹继刚等f1999)¨12】应用本法检测了牛粪便中隐孢子虫卵囊抗原。学者LefayDetal(2000)[841采用定性ELISA对法国犊牛隐孢子虫感染情况进行调查，在1628份奶牛粪便中，阳性率为17．9％。4．2．2免疫荧光试验(IFA)直接取卵囊涂片或利用病鼠回肠粘膜切片作抗原，在荧光显微镜下，依据其色度和形态可分辨出卵囊的各发育阶段。卵囊经荧光抗体标记后，荧光显微镜下显示苹果绿的荧光，极易辨认⋯3’“”。该法具有高度的敏感性、特异性和重复性，缺点是必须有荧光显微镜。本法有助于抗原和抗体的分析、鉴定和定位检查，还可用于探索抗原的分布和抗体形成的部位以及研究免疫反应的本质和寄生虫免疫的病理机制。分为直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验两种。Bing—MUHSUet口，(1999)¨叫采用IFA对台湾省6个自来水厂进行隐孢子虫检测，结果5个自来水厂已受到隐孢子虫污染，卵囊密度为2．3～40个／100L水。IzumiyamaSetal(2001)l”J采用乙酸乙酯浓集法和免疫荧光染色法、陆绍红等(2000)[331采用改良抗酸染色法和免疫荧光染色法用于隐孢子虫流行病学研究。与单克隆抗体相结合的IFA技术，检测敏感性和特异性均在90％以上，甚至可达100％水平。其敏感性至少是抗酸染色法的10倍以上。4．2．3单克隆抗体(McAb)技术目前该方法已广泛应用于临床病例粪便中隐孢子虫卵囊的检查和水源及周围环境中隐孢予虫卵囊污染程度的判断和检查动物小肠组织病理标本和细胞培养中不同发育阶段的隐孢子虫。应用单克隆抗体鉴定予孢子膜上的多肽，有助于虫体抗原成分的研究和虫体的鉴定。胡景辉等(1995)⋯5J首次建立了抗鼠隐孢子虫卵囊的单克隆抗体，获得的5株单抗均不与贝氏隐孢子虫及柔嫩艾美耳球虫产生交叉反应，与小隐孢子虫则有不同程度的交叉反应。宗海红等(1998)1116,“71制备出 圆株能稳定分泌抗隐孢予虫擎克隆抗体杂交瘩细胞株，时其特辩性进行了研究，并探讨了抗隐孢予虫单嵬隆抗体的机理。该滋具有较高的祷辩往，羹敏感瞧是改淹抗酸染色法敏感靛静10结瑷上。SturdeeAPetal(1999)t63】应用抗隐孢子虫雌克隆抗体，从英格兰184份野生动物的粪簌中捡溅密22镪疆瞧，疆链率走12％。粱俊文等(2000)13s]鼹l：3蔗糖溶液漂浮法和抗隐孢子虫单克隆抗体对南京地区奶牛场隐孢子虫感染情况进行了调查，乎均感染率兔29。1％(16／55)。学磐PedrazaDSefalt2001)t¨81采用PCRIRFLP从2000多入的粪便中检出19侧阳性病人，娼抗隐孢予虫卵囊单克隆抗体鉴定为火鸡隐孢子虫。4．2．4免疫即遮技术免疫印迹技术是将聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫转印技术结合起来秘～释方法。本法可黻敏感壤识嗣隐穗子氆峁囊23KDa抗簇淤及20KDa子孢子抗原的特异性m清抗体，主娶用于隐孢子胀病的瓶清学捡查。JenkinsMCet群Zfl995){“9】应耀Westernblotting涯实C．parvuml5／60重组蛋白可被C．parvum感染恢复期牛血清及高效价免疫牛初乳识别。FrostFJet牙ff{998)t“靶越嗣ELISA秘Westernblotting检测隐跫予虫抗体后认为抗隐孢子虫特异性IgO、IgA可能在检测隐孢子胀上有重要意义。4．2．5反向被动血凝及应(RPH)将处理过的卵囊抗原加入预先制备好的标记裔绵羊红细胞抗隐孢予虫辩囊豹荜竞隆抗体静反应板，抗原抗体反应藤，借驹反应孔底部红细胞的凝集以判断阳性反应。FarringtonMetd，(1995)ll2l】对RPH与改楚Zeihl．Neelsen秧了馥较，结果RPH敏感注为爹2．7％，特辩往秀85．6％。阳性预测值78．4％，阴性预测值95．4％。4．3分予生物掌诊断随罄分子生物学技术的突飞猛遴，以PCR为核心豹慕嚣诊凝技本具有简便、快速、准确、敏感性高和特异性强等优点，融广泛j藏用于寄生虫瘸的诊断。srDNA基因在生物进化道程中舆有商殿保守燃，在寄生虫避亿杌铡釉系统重建研究上怒一稀有效酶分子标记，已成为系统发育分析、瘸原学诊断、鉴别隐孢子虫种类及其基因型的重要靶基鑫之一。逐年来溪内舞不少学蠢应蔫srDNA序列设计雩|物麓PCR检灞隐孢子虫[122】。4。3．1常规PCRLaxeretat(1991)¨船】首次将PCR技术用于隐嘏子虫瘸研究中，极大的提毫了隐斑子虫瘸诊断懿敏感瞧翻特爨建，开辟了该病诊裁款颓14 途径。PCR法的建立烙分子生物学发展史上的一次革命，已成为分子生物学领域最常用的方法之一。该方法使在体外从微量模板DNA合成丈量特髯DNA成为现实，PCR技术检溅入和动物粪便中翡隐穗予虫，敏感性比目前常用的梭测方法约高lOO倍。有望成为隐孢予虫病诊断帮流行瘸学调惫雏毒力手段。骂良等f1996)[Ⅲ1、郭多警等(1998)【拉5l先后成功地应用PCR技术检测粪便中的隐袍子虫，李建华等(1999)¨“1寝嗣PCR建立了一耱诊装入及串等穗嚣动谚隐憨予鱼痰熬方法，该方法可检出鼠隐獭子虫和小隐孢子虫卵囊，所建立的PCR方法适合于人、牛等螓飘动物隐强予虫瘸的妫藤诊凝和流行病学调查。现有的PCR诊断技术检测阀值为400个卵囊／mL样品[1261，这对予含卵囊数量少的潜伏期与恢复期瘸人、无症状惜虫者的粪便标本以及污染食品、饲料帮水源中微量隐穗子虫卵囊的检测十分困难。近年来国外一些学者在PCR基础上进行了进一步研究，建立了许多道敏感的诊断方法，翔PCR．杂交灞定法等，对隐獾子蛊孩酸分子进行研究，取得了⋯些进展，深化了对该虫生物学的认识，促进了隐孢予盥病诊凝豢|薅滚方法熬发震，大大援裹了诊瑟懿特异瞧秘敏感蛙。不少学者已证实遗些方法在隐孢子虫流行病举研究、基因分型、微量检测隐孢予虫等谗多方躐有重要撰罴【l”l。4．3．2NestedPCRNestedPCR是根据靶向扩增序列设计如初始PCR引物，其产物再经过第二套Sf物扩增特异性大小的DNA片段，从而达到检测的目的。该方法敏感性怒常规PCR的103倍以上、是漂浮法和染色法的1O5倍以上。GuanZet牙嚣1998)报道¨281，穰箨隐獠予虫srDNA孝列，设诗出隐孢子擞属特异性的PCR初始引物和小隐孢子虫种特异性引物，可扩璞540bp霹165bpDNA片段。裙始PCR稻NestedPCR哥分澍检测窭10pg和l起的卵囊DNA。Wiegeretal(1999)哺lj应用NestedPCR结合黢制性酶切分掇，对人莘珏动物小隐薅子虫橡避厅鉴划分掇。NestedPCR怒一种较好的微量隐獭予虫卵囊检测技术。目前，该方法已用于环境及水源[129,1301。该技术具有较高的特异性秘敏感性，可以检测食品及环境中微量隐猕子虫辩囊，程食品卫生检验和环境污染激测中矮有广润的推广应用前景。4．3．3PCR结合探赞襁记技术该方法是根据PCR扩增的DNA序列，设计～段特异性寡聚核苷羧，采瘸放射瞧或菲教麓毪耘记，蒜对PCR产物透行杂交嚣这翻检测目的。Websteretal(1993)¨3ll用同位素对30bp寡聚核菅陵标记，结果袭明具套耪筑憋舅牲。陈雅棠等(1998)t垃71剩羯PCR缝合缝裹辛拣记豹 寡聚核苷酸探针技术检测经PCR扩增后的人粪便中小隐孢子虫DNA，可检测出至少fg水平的CparvumDNA，比抗酸染色法及免疫荧光染色法检测粪便中卵囊的敏感性大约分别高5×104和5×10’倍。4．3．4随机扩增多态DNA(RAPDPCR)该方法以PCR为基础，使用随机序列的单个短引物，这些随机引物与基因组DNA模板序列最同源的部位在不严格的条件下结合，在经过凝胶电泳分离及溴化乙锭染色后，这些DNA片段可产生一种特异性的指纹图谱，有助于隐孢子虫的种类鉴别，区别不同组织中隐孢子虫分离物的差异，显示隐孢子虫的基因特征。RAPDPCR分析产生的一些多态片段具有种特异性，并且出现在同一种的所有个体中，与常规PCR比较，具有敏感性高、快速简便的优点。CarrawayMelal(1996)¨321应用该方法对C．parvum的基因特征进行了描述。同年，Morganetal¨珥J等应用RAPDPCR可直接从粪样中检测出l～10个卵囊的DNA样品，1997年【78】他们发现用该方法可以得出隐孢子虫株的差异性。4．3．5PCR连接的限制性酶切片段长度多态性(PCR．RFLP)将基因组的一段明确的序列用特异的引物通过PCR扩增，将扩增产物用一种或多种限制性内切酶消化，然后将限制性片段用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后在紫外线照射条件下检测【1]“。MclauchlinJetal(2000)t83】采用PCR．RFLP法对1705头和105头家畜粪样进行隐孢子虫感染情况调查。调查结果：患者病原体中，基因型1(只感染人)占17．85％，基因型2(其宿主广泛)占61．5％，另有基因型3(火鸡隐孢子虫)占0．3％，基因型1和2混合感染的占0．4％，所有受测家畜均为基因型2感染。XiaochuanFengetal(2000)【134J采用本法证实了C．parvum存在广泛的多态现象。ElwinKetal(2001)【”5建立了巢氏PCR。RFLP用于识别隐孢子虫基因位点多态性，这种方法更敏感、更特异。4．3．6反转录PCR(RTPCR)该法的原理是活性卵囊具有蛋白质表达功能，卵囊产生mRNA，通过mRNA反转录成DNA，再进行PCR。Stenearelat(1996)t1361首次把RTPCR用于隐孢子虫的检测：1997年Rochelleelal[61采用此法检测污水中有活力的卵囊。GriffinDWelal(1999)[67】用RTPCR对佛罗伦萨州运河水进行隐孢子虫污染程度检测。与普通方法相比，RTPCR敏感性达到10个卵囊，可以区别卵囊有没有感染力，这在流行病学研究中有重要意义。5防治 5．1治疗5．1，1药物疗法迄今国内外已试用过百余种药物治疗隐孢子虫病，但效果都不理想⋯。侯云圣等(1991)【991报告用螺旋霉素治疗小儿隐孢子虫病患者有一定临床疗效；MurielNacirietal(1993)1137J证实了乳酸常山酮可以降低临床隐孢子虫病的严重程度，其功效具有剂量依赖性；不少国内学者应用中草药治疗隐孢子虫病，陈有贵等(1993)【138】报道苦参合剂、戈建军等(2001)t74】报告应用大蒜素治疗本病具有一定疗效；等等。但这些试验均缺乏临床对照病例的观察。曹小明等(1994)‘”9】认为交沙霉素、大蒜素、甲硝唑、复方新诺明等四种药物对雏鸡实验性隐孢子虫病有一定治疗作用。刘毅等f1992)f”01也有类似的报道。此外还有关于巴龙霉素、拉沙里霉素、西尼霉素和脱氢雄淄酮等药物能在一定程度上有效地治疗隐孢子虫病的报道【14”，但所有这些药物只能控制症状，停药后疾病易复发。注重缓解因急性腹泻而导致的脱水及其它对症的合并治疗是目前常用的方法。主要包括止泻、及时输液，补充电解质，纠正酸碱平衡等。由于免疫功能健全的宿主的感染多数具有自限性，因此在没有其他肠道致病微生物存在时，采取补液疗法以缓解急性腹泻造成的脱水【142l。5．1．2免疫疗法国内外学者曾采用IgG、IgA、乳清、免疫胆汁、转移因子、CD4+细胞和Y一干扰素等方法来治疗隐孢子虫病【14¨，但疗效不确切；最近有学者发现针对隐孢子虫子孢子P23抗原表位的IgAMabs对抵抗MurineCparvum感染有保护作用[143】；尹继刚等(2003)1144】克隆了针对隐孢子虫子孢子表膜的单抗细胞株单链抗体(ScFv)基因，为制备重组毒素以杀灭隐孢子虫奠定了基础。5．2预防鉴于隐孢子虫对常用的消毒剂有明显的抵抗力，目前还没有筛选出用于治疗的特效药物，所以平时预防就显得特别重要。预防可以从加强卫生措施和提高机体抗病能力来控制本病的发生，尚无可值得推荐的预防方案。5．2．1加强卫生措施病愈动物能长期带虫并不断地向外界排出卵囊，因此必须注意其粪便管理，对粪便进行堆积发酵，防止污染环境，所以应搞好环境卫生，防止食物和水源污染：应适当隔离病人病畜，并积极治疗：阻断 传播途径：傈护免疫功能缺陷或低下静入、畜，避兔与瘸入(畜)接触。5．2．2提高机体校病缝力隐怼子虫瘸必容限燃感染，免疫功能正鬻魏个体一般可自愈。改饕饲蓐镑理条馋，增强机体灸疫力，可有效地提高枫体抗瘸能力。近年来，阑内外学者对隐孢子虫瘸的免疫预防进行了磺究。大多数学者认为隐孢子虫子孢予表面蛋白是产生免疫保护的主要因桊，FrostFJetal(1998)[¨5】发现隐孢子虫子孢子表面15／17kDa抗原产生的抗体能在体内存在相当长的时间，髓效价几乎不下降。学者StrongWBetal(2000)I¨61利糟从衣阿华州患隐孢子虫病奶牛粪便中分离出的C．parvum构建了稳孢子虫子獾予eDNA文库，为筛选出兵有潜在的预防俸角瓣编码基戳羹定了基礁；LiuCetat(1999)¨4珥梅建了容蹩为lO．4mb基因缀文库。傣宏轩等(2002)l蚪8l剥弱PCR技拳，铁牛添C．parvum蒸困组中交隆出了子毪予表嚣拭愿基因gp23基因，著认必该基因是磷制隐炮予虫核酸疫越的主要镞选基因。CPl5／60蛋白是隐斑予墩子孢子表面骚自，具有高度的免疫原性和反应原性，被认为是～种很有前途的疫苗候选抗原，何宏轩等(2003)[149J利用隐孢子盥子孢子表面蛋白CPl5160的重组质粒免疫小鼠，ELISA法证实了特弊抗体的存在，淋巴细胞转化试验结果表明，淋巴细胞在体外增殖反应增强。6展望尽管国瘗箨学者黠入畜隐稳子盔瘸懿研究已取得一定成就，毽莱些方嚣满存在差鼹，譬热：没蠢统一豹分类方法；入畜隐斑予虫瘸数感染情况以及野生动物的感染馕况巍无系统瓷料：发病机理翻免疫枫理逝未阐明清楚：免疫诊断方法浅未大嫂模推广应用；由于目前关予隐孢子嫩的体外培养尚处于研究的初级阶段，因此，还很难获得大量的卵囊满足实际应用；尚未筛选出～种治疗隐孢子虫感染的特效药物；隐孢子融分子生物学的研究剐刚起步，许多分子生物学诊断方法尚未应用于隐孢子虫瘸的临床诊断，尚未筛选出潜在的舆有免疫和治疗作糟的候选抗原基因，等等。当务之急怒要进行隐孢子虫病流行病学调态。蔽掌握该瘸静流行特点和发生规律，为稍定隐绝子虫瘸静防治措蕤提供理论寝据；露瓣瘦建立麓予辩霹能的抗隐孢子虫纯学治疗药辘进行系统谖绘赞动甥模型，进行隐魄予虫病蘩款鲸选方琵鹄研究，以嫂解决臆孢子嫩瘸治疗这一世界性难题。 材料与方法1材料1．1实验动物昆明系小鼠购自安徽医科大学实验动物中心，20日龄1．2牛源隐孢子虫9日囊本实验室分离、保存(分离时间：1999．8)1．3主要试剂及配制1．3．1甲醇北京化工厂1．3．2金胺酚一改良抗酸染色液(AP—AFS)1．3．2．1金胺一酚染色液染色液l金胺(AURAMINO)苯酚蒸馏水(dH。0)染色液2盐酸95％乙醇染色液3高锰酸钾dH。01．3．2．2改良抗酸染色液染色液1碱性复红苯酚95％乙醇dH。00．1gog100mL3mL100mL0．5g100mL4g8mL20mL1OOmL 染色液2硫酸d1t。0染色液3(贮存液)孔雀绿dII：0染色液3(工作液)染色液3(贮存液)d11201．3．3饱和白糖溶液白糖苯酚dll：01．3．4p117．40．0lM磷酸缓冲液(PBS)0．2MNaH：PO。·21t200．2MNa2ltPO。·121t20加dH20至1000mL1．3．5Sheather’S蔗糖溶液(Sheather、’S蔗糖苯酚蒸馏水1．3．6应用蔗糖溶液lOmL90mL0．2glOOmL1mL10mL454g6．7mL355mL9．5mL40．5mLS01Ution)500g6．7mL320mL用Sheather’s蔗糖溶液与PBS按下表以不同比例混合20 应用蔗糖溶液1．3．7ddH20(双蒸水)自制1．3．810×PCR缓冲液华美生物工程公司上海分公司1．3．9引物根据隐孢子虫srDNA的基因序列，参照参考文献[150I，由中科院上海生化所合成，批号ID76841，该引物为隐孢子虫属所特有。上游引物5’．GGGTTGTATTTATTAGATAAAGAAC．3’下游引物5’．CTTTAAGCACTCTAATTTcTC一3’1．3．10Taq酶5U／gL，Promega公司1．3．1lDNAMarker200bpDNALadder，批号0912032C，华美生物工程公司1．3．12电泳缓冲液1×TAE，稀释自5×TAE，Tris24．2g，O．5MEDTA(pH8．0)10．0mL，冰醋酸5．7mL，定容至1000mL。1．3．13溴化乙锭(EB)10mg／mLSigmaEB751分装1．3．14琼脂糖华美生物工程公司上海分公司，电泳时用1×TAE配制成l％凝胶，加溴化乙锭至终浓度O．599／mL。1．3。l5dNTP华美生物工程公司上海分公司1．4药品1．41醋酸地塞米松片(DEXAMETHASONE，DEX)O．75mg／片，上海信谊药业有限公司，批号020401用DEX与蒸馏水按不同比例混合O．5mg／100mL：一粒DEX片剂溶于150mL蒸馏水中1．0mg／100mL：一粒DEX片剂溶于75mL蒸馏水中1．5mg／100mL：一粒DEX片剂溶于50mL蒸馏水中1．4．2百毒杀S(BESTAQUAM·S)上海派斯德生化有限公司2 1．5主耍仪器NikonYS2双星生兹显镞镶嫩衷江麓走电(集毯)股份爨疆公司OLYMPUSAH型垒是动摄影系统日本LD4．2A低速台式离心机北京离心机厂800型离心沉淀嚣上海手本器壤厂高速离心机TGL．16B，上海寰亭科举仪器厂电泳仪JM．250，宁波耨芝生物科技jl殳黔有缀公司电热恒温水槽DK．8D，上海精密实验设备肖限公司紫终透射发袈分掇经KH—uV，上海壤禾光电仪器鸯限公司压力控制嚣上海博讯实业有限公司兹擞式援力天乎TN型，上海第二天平致器厂PCR仪DNAThermalCycler480，熬国PE公司振荡器WH一2微型旋涡混合仪，上逮沪嚣分辑仪器厂凝胶分析系统lmagermasterVDSphamaciaBiotech公司TanonGIS凝获鬻象处骥系统基本OlympusLTD2方法2．1猪黪缒子虫病流缔癍学调查2．1．1应用病原学方法检测猪粪便中隐孢予虫2．1．{．1滔疆熹豹选撂在安徽省境内选择淮北地区的风台县、蒙城县、灵壁县和卓阳市，辽灌之瓣豹会瓣毒、滁髑泰秘六安露、太濒县，皖南由送戆东楚县、巍州市和黟县等11个妊、市作为调研点。从每个调研点猪群中取不同年龄、梭别的猿作为调蟥对象，共采集739头猪弱掰鲜粪撵。2．1．I．2粪样的采集和保存对德检猪逐头登记，内察包括紊主姓名、猪豹年龄、性别、骠情及粪便外观等。然后采集每麸猪的新鲜粪便50～60g，编号后装入塑料袋，置于4℃的冰箱中保存待检。2．1．}．3虫体的检查取10g粪榉，加水搅匀，经60目铜丝筛和260目尼龙筛分别过滤， 滤液静置lh，倾去上清液，把沉渣倒入4支离一tl,管中，3000r／min离心lomin。取其中2支离一11,管中的沉渣少许涂片3张，先用金胺酚法染色，再用改良抗酸法复染。用1000倍油镜检查卵囊，观察其内部结构，测量其大小：另2支离一tl,管中的沉渣保存于25％重铬酸钾中备用。然后用饱和白糖溶液漂浮沉渣，3000r／min离心10min后，用直径为08cm的铁丝圈蘸取表层液膜，400倍光镜下观察，1000倍油镜下测量，分别在显微镜下拍照染色法和漂浮法所见隐孢子虫卵囊。2l4结果的判定隐孢子虫卵囊的鉴定主要是根据有关文献资料【39，42，151，””。隐孢子虫感染强度的判定标准为：(1)金胺酚．改良抗酸染色法：用油镜观察每个粪样的3张涂片，每张涂片观察10个视野，发现卵囊即判为阳性。平均每个视野1个卵囊表示为“+”，2个卵囊表示为“++”，3个卵囊表示为“+++”，4个以上卵囊表示为“++++”。未发现卵囊者为阴性，表示为“一”。(2)饱和白糖溶液漂浮法：用400倍生物显微镜观察每个粪样3张漂浮液涂片，每张涂片观察10个视野，发现卵囊即为阳性。平均每个视野1～5个卵囊表示为“+”，6～10个卵囊表示为“++”，ll～20个卵囊表示为“+++”，20个以上卵囊表示为“++++”，未发现卵囊者为阴性，表示为“一”。2l15数据处理所有数据均采用卡方检验处理、分析。2I2应用PCR方法检测猪粪便中隐孢子虫2121样本来源对上述保存于2．5％重铬酸钾中的739份猪粪样重颏编号，取编号为l，6，11，16，21⋯⋯736的样品作为待检样本，共148份，以本实验室保存的牛源隐孢子虫卵囊作为阳性对照。2l2隐孢子虫的DNA抽提参照李培英等(1999)t150】建立的PCR方法，略有改动。取待检粪便悬液lmL、Sheather’s蔗糖溶液9mL，于15mL离心管内振荡混匀，在溶液上端小心加入蒸馏水lmL，3000r／min离心10min，收集离心管上部含有卵囊的水层，用蒸馏水洗涤3次，再将沉淀重悬于消化液(1×TE，2％DTT)150pL中，液氮反复冻融3次，然后在90℃水浴中放置20min，13，000r／min离心5min，上清即为PCR模板DNA，．20℃保存备用。2123PCR反应 在50pLPCR反应管中，加入下列反应物：灭菌重蒸水l35IlL，10×PCR缓冲液25¨L，4×dNTPl¨L，上、下游引物各2pL，样品DNA3laL，Taq酶luL，混匀。反应条件为94℃4rain，然后94℃lrain，52℃2rain，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延长7min。2l24PCR产物分析取5uL扩增产物，在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察特异条带并拍照。2l25PCR方法检测结果与病原学方法检测结果比较2隐孢子虫动物模型的建立21隐孢子虫卵囊来源鼠隐孢子虫(Cryptosporidiummuris)卵囊，从滁州21号猪体内分离。小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)卵囊，从凤台县张岗猪场12号猪体内分离。22隐孢子虫卵囊分离与纯化21卵囊分离取阳性粪样50g，加清水1000mL，搅匀成粪液，分别经60目铜丝筛和260目锦纶筛兜过滤，滤液收集于塑料量杯中，静置沉淀1h，弃上清液(约弃上层4／5)，沉渣(含液体)3000r／min离心15rain，弃上清液，收集沉淀。2卵囊纯化】：2蔗糖液粗提取l：2蔗糖液于离心管中，沿管壁缓缓加入2倍体积的样品，3000r／min离心15min，吸取中层液体于烧杯中，与10倍体积的PBS混匀，3000r／min离心15min，沉淀用PBS悬浮。1：3蔗糖液粗提取l：3蔗糖液5mL于离心管中，沿管壁缓缓加入2mL粗提液，3000r／rain离心15rain，吸取卵囊层，立即加入10倍体积的PBS，混匀后3000r／rain离心15rain，沉淀用PBS悬浮。蔗糖密度梯度离心纯化卵囊取l：35蔗糖液3mL于离心管中，沿管壁缓缓加入l：5蔗糖液2mL，随即加入2mL粗提液，3000r／min离心l5rain，吸取1：35和1：5蔗糖液之间的卵囊层于另一离心管中，立即加入10倍体积的PBS，混匀，3000r／min离心l5min，沉淀用PBS洗涤2次，PBS悬浮，加入等体积5％重铬酸钾，4℃保存备用。23筛选小鼠最佳免疫抑制剂量试验前对饲养场地、鼠笼和饮水器等器具用l％百毒杀进行消毒，器具晾干后在紫外灯下消毒30分钟。把40只昆明系小鼠随机分成甲、乙、丙和丁四个组，每组10只，24 其中甲、乙、丙组为试验组，丁组为非免疫抑制对照组。连续三天观察_、鼠的饮、食欲，精神及其它有无异常，并用自制的鼠粪收集筛收集_、鼠的粪便，检查隐孢子虫卵囊，确认无卵囊排出即可用于本次试验，以饮水的方式用地塞米松(DEX)0．5mg／100mL、1．0rag／100mL和1．5mg／100mL的免疫抑制剂量让甲、乙、丙三组鼠自由饮用直至本次试验结束，试验时间为35天。每天收集鼠粪进行隐孢子虫卵囊检测。2．2．4人工感染小鼠试验把60只小鼠随机分成A、B、c、D、E和F六个组，每组10只，分笼饲养，试验时间为35天。试验前的消毒、观察和检查同于2．2．3。从接种卵囊前5天开始，A组以饮水的方式用地塞米松(2．2，3试验结果)让鼠自由饮用直至本次试验结束，同时用移液器吸取60¨L卵囊液(内含C．muris卵囊为1．75×106个)经口灌入每只小鼠体内；B组接种与A组相同数量和体积的C．parvum卵囊，免疫抑制药物、方法、剂量及人工感染方法同于A组；C组为非免疫抑制组，同A组方法、数量接种C．muris卵囊；D组为非免疫抑制组，同B组方法、数量接种C．parvum卵囊；E组为免疫抑制对照组，免疫抑制药物、方法和剂量同于A组，但不接种隐孢子虫卵囊：F组为非免疫抑制对照组，既不进行免疫抑制，也不接种卵囊。同时，每天观察、记录小鼠饮、食欲，精神、粪便等有无异常，对死亡小鼠进行剖检，观察其病理变化。2．2．5小鼠隐孢子虫卵囊排出情况观察在接种隐孢子虫卵囊后当天开始收集粪便，以后每天收集粪便1次，加适量自来水，搅匀成粪液，分别经60目铜丝筛和260目锦纶筛兜过滤，滤液经3000r／min离心15min，弃上清液，收集沉淀。用2．2．2．2方法纯化隐孢子虫卵囊，用血球计数板进行卵囊计数。计算公式：排卵囊数(个／克)=密度(个／毫升)×体积(毫升)÷鼠粪克数(克)2．2．6虫种鉴定在1000倍油镜下观察卵囊内部结构，测量其大小，并拍照，根据有关文献资料‘39，42，151，152】进行虫种鉴定。 结果与分析l猪隐孢子虫病流行病学调查1病原学方法检测结果l1虫种鉴定经金胺酚．改良抗酸染色，阳性涂片在高倍镜下见到蓝绿色背景下有小红亮点即为卵囊。油镜下观察，小红亮点呈鲜艳玫瑰红色，有的卵囊较小，呈近圆形或卵圆形；有的卵囊较大，呈椭圆形或卵圆形。有的卵囊着色深，内部结构明显：有的卵囊着色浅，内部结构不够清晰或不显示。囊壁外周大多有无色透明的折光环带，似晕圈状。卵囊内有4个月芽形或逗点状的子孢子，还有一团颗粒状的残体。无孢子囊。左油镜下分别测量50个近圆形和椭圆形卵囊。椭圆形卵囊大小为63～741．tm×50～55um，平均为(67l±096)um×(523±015)um．形状指数为126～1．35，平均128。根据卵囊的形态和测量结果，初步鉴定为鼠隐孢子虫(Cryptosporidiummuris)。见图1。近圆形卵囊大小为39～54“irl×38～48um，平均为(451±044)um×(427±033)um，形状指数(长／宽)为1．02～l，l7，平均1．06。初步鉴定为小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvumj。见图2。虱l金胺酚-改良抗酸染色法(鼠隐孢子虫，2200×)箭头所指为卵囊Fig1MicroscopyofCmurisoocystsdyingbyAP-AFS27 图2金胺酚．改良抗酸染色法(小隐孢子虫．2200×)箭头所指为卵囊Fig2MicroscopyofCparvumoocystsdyingbyAP-AFS粪样经饱和白糖溶液漂浮后，油镜下观察，有的卵囊较小，近圆或卵圆形；有的卵囊较大，椭圆或卵圆形。卵囊壁薄而光滑，内含四个弓形子孢子和一团残体，无孢子囊。卵囊内部呈淡红色。在油镜下分别测量50个近圆形和椭圆形卵囊。椭圆形卵囊大小为67～76umX51～57“m，平均为(7．00±0．27)“m×(5．34±0．17)lam，形状指数为l28～1．36，平均l31，根据卵囊的形态和测量结果，初步鉴定为鼠隐孢子虫(Cryptosporidiummuris)。见图3。近圆形卵囊大小为3．8～54[am×36～48p．m，平均为(4．57±049)um×(415±044)um，形状指数(长／宽)为103～1．18，平均I10，初步鉴定为小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)。见图4。图3饱和白糖溶液漂浮法(鼠隐孢子虫，2200×)箭头所指为卵囊Fig3MicroscopyofC．murisooeystsconcentratedbysaturatedwhitesugarfloation 图4饱和白糖溶液漂浮法(小隐孢子虫，2200×)箭头所指为卵囊Fig4MicroscopyofCparvumoocystsconcentratedbysaturatedwhitesugarfloatiOill12安徽省猪隐孢子虫种类及其地理分布情况本次调查共采集安徽省11个县、市739头猪的新鲜粪样，采用金胺酚．改良抗酸染色法和饱和白糖溶液漂浮法的检测结果分别见表1和表2。表1安徽省猪隐孢子虫种类及其分布情况(金胺酚．改良抗酸染色法检测结果)Table1Thevarietyandit’sdistributionofCryptosporidiuminswinesinAnhuiprovince(DetectionofoocystsbyAP-AFS) 表2安徽省猪隐孢子虫种类及其分布情况(饱和白糖溶液漂浮法检测结果)Table2Tilevarietyandit’SdistributionofCryptosporidiuminswinesinAnhuiprovillce(Detectionofooeystsbysaturatedwhitesugarfloation)从表l、2可以看出，安徽省境内广泛存在猪隐孢子虫病原，各县、_lf的感染率高低不等，其中以风台县感染率最高。而且不同地区猪隐孢子虫病病原种类不同。风台县猪隐孢子虫病的病原为C．parvum，没订检测到C．muris；东至县猪隐孢子虫病的病原为C．muris，没有发现(’．parvum；合肥、蒙城、阜阳、太湖、滁州、六安、黟县、灵璧和太湖猪隐孢予虫病的病原为C．muris和C．parvum；在合肥、灵璧、太湖i个县、市还发现7头猪同时感染2种隐孢予虫；宣州市没有检测到猪隐孢子虫。两种方法检出的总感染率分别为2720％并112679％，经卡方检验，其差异不显著(P>005)，且各调研点两种方法检测的感染率亦相同或很接近。30 1．13安徽省猪隐孢子虫感染强度及其分布情况对金胺酚一改良抗酸染色法和饱和白糖溶液漂浮法检出的阳性猪隐孢子虫感染强度进行统计，其结果见表3和表4。表3安徽省猪隐孢子虫感染强度及其分布情况(金胺酚．改良抗酸染色法检测结果)Table3ThedegreeanditlSdistributionofCryptosporidiuminfectioninswinesinAnhuiProvincefDetectionofoocystsbyAp-AFS)从表3可以看出，安徽省各县、市猪隐孢子虫感染强度普遍较低，感染强度为十++的有4头，占阳性头数的1．99％(4／201)，感染强度为++++的有8头，占阳性头数的3．98％(81201)。其中风台县高强度感染的猪头数最多，感染强度为+++的有3头，++++的有5头。 表4安徽省猪隐绝子虫感染强液及其分布情况(饱和白糖溶液漂浮法检测结果)Table4Thedegreeandit'sdistributionofCryptosporidiuminfectioninswinesinAnhuiProvince(Detectionofoocystsbysaturatedwhitesugarfloation)从表4可以看出，采用饱和白糖溶液漂浮法捡测的猪隐孢子虫感染强度及其分布情况基本与金胺酚．敬良抗羧染色法的检测结果一致。感染强度为++的有14头，+++的有6头，束发现感染强度为+++十的猪。亦是风台县高强度感染(+++)的猪最多，达4头。1．1．4幂筒地鬣猪隐孢子虫感染情况对淮北地酝4个县、市(蒙城凝、阜闭市、灵璧县和风台县)305头猪、江灌之闷4个慧、市(合肥市、滁州市、六安市和太潮瑟)3ll头猪和皖南山区3个数、市(东至县、黟县和宣州市)123头猪隐孢子囊感染债蒎送行统诗、分疆。嚣秘方法靛稳溅缝聚分甏凳表s鞠表6。 表5不同地区猪隐孢子虫感染情况(金黢酚．酸楚抗羧染色法稔淤结聚)Table5TheprevalenceofCryptosporidiuminfectioninswinesinvariousareas(DetectionofoocystsbyAP—AFS)表6不蘑越区猪戆穗子虫感染漕况(饱和白糖溶液漂浮法检测结果)Table6TheprevalenceofCryptosporidiuminfectioninswinesinvariousareas(Detectionofoocystsbysaturatedwhitesugarfloation)分剐对表5和表6数据进行卡方检验得出：淮北地区猪隐孢子虫感染率极鼹著的高于江淮之间和皖南山区，江淮之间和皖南山区猪隐毽予蛊惑染率差舞显著。说羁蜜徽省猪隐孢子虫感染存在明显的地区性差异，其中淮北地区猪隐孢予虫感染率最高，这可能譬当地经济水平、镪养镑理方式、翌生习。蒺秘遮理琴壤等裁素鸯关。1．1．5不问年龄段猪隐孢子虫感染情况对不凝年龄段猪戆斑子蛊感染祷蕊进{亍统诗分析，两零中方法酾结果分别见巍7和袭8。 表7不同年龄段猪隐孢子虫感染情况(金胺酚．改良抗酸染色法检测结果)Table7TheprevalenceofCryptosporidiuminfectioninswinesatvariousages(DetectionofoocystsbyAP—AFS)年龄段检查头数阳性头数阴性头数感染率％表8不同年龄段猪隐孢子虫感染情况(饱和白糖溶液漂浮法检测结果)Table8TheprevalenceofCryptosporidiuminfectioninswinesatvariousages(Detectionofoocystsbysaturatedwhitesugarfloation)从表7、8可以看出，各个年龄段猪均可感染隐孢子虫，但不同月龄猪隐孢子虫感染情况不同，分别对表7和表8感染率之间差异性进行卡方检验，4月龄以内猪感染率极显著高于其他两个年龄段的猪，而4～8月龄(含8月龄)和8月龄以上猪的感染率间差异不显著。4月龄以内(含4月龄)猪隐孢子虫感染率最高。这和多数学者的结论完全吻合[52,153】。原因可能是由于猪的年龄小，机体的免疫机能尚未发育完善所致。1．1．6不同性别猪隐孢子虫感染情况对感染情况最严重的凤台县不同性别猪隐孢子虫感染率间的差异性进行统计分析，金胺酚．改良抗酸染色法检测公猪和母猪的感染率分别为53．85％(42／78)和54．76％(46／84)；饱和白糖溶液漂浮法检测公猪和母猪感染率分别为53．85％(42／78)和52．38％(44／84)。卡方检验 结果，其差异性不显著(P☆=O9493>O．05和Pw=09177>O05)，说明猪隐孢子虫感染率与性别无明显的关系，此结果与有关报道相一致13”。l2PCR方法在猪粪便隐孢子虫检测中的应用1．2．1PCR产物电泳鉴定从含有鼠隐孢子虫卵囊(滁州2l号猪)、小隐孢子虫卵囊(张岗12号猪)和病原学检测呈阴性而PCR检测呈阳性猪粪样(灵璧27号猪)提取DNA，以牛源隐孢子虫DNA作为阳性对照，ddH20作为阴性对照，用同一引物，在相同条件下进行PCR扩增，产物电泳后，其结果如图5。从滁州2l号猪、张岗12号猪、灵鐾27号猪粪样及牛源隐孢子虫均扩增出540bp特异性片段；ddH20未见540bp的特异片段。1．2．2猪粪便样品检测采用PCR方法对148份猪粪样进行检测，结果检出阳性粪样47份，检出率为3176％(47／148)。1．2．3PCR与病原学方法的比较在148份猪粪样中，采用金胺酚．改良抗酸染色法判为阳性的猪粪样有38份，这38份阳性粪样经PCR检测全部呈阳性，阳性符合率为100％；采用饱和白糖溶液漂浮法判为阳性的猪粪样有37份，这37份猪粪样，采用金胺酚．改良抗酸染色法和PCR检测亦全部呈阳性，阳性符合率为100％。l份粪样(蒙城54号猪)采用金胺酚．改良抗酸染色法判为阳性，而经饱和白糖溶液漂浮法判为阴性，应用PCR方法检测呈阳性。在采用金胺酚．改良抗酸染色法判为阴性的110份猪粪样中，有9份经PCR判为阳性，说明PCR方法检出率明显高于病原学方法。但病原学方法对实验条件要求不高，在一般实验室均可以进行，对感染强度较高的粪样检出率几乎与PCR方法相同。因此，可根据待检样品中隐孢子虫卵囊数量而选用不同的方法。 图5PCR扩增产物电泳图谱lddH!O对照；2猪源C．parvum扩增产物；3病原学检测呈阴性猪粪样扩增产物：4200bpDNALadder；5猪源C．muris扩增产物：6牛源隐孢子虫扩增产物：Fig5ResultsofelectrophoresisofPCRproductsamplifiedLanelnegativecontrolwithddH20：Lane2PCRproductofswine—derivedCp口，～“m；Lane3PCRproductofnegativeswine-derivedsamplebyetiologicalmethods；Lane4200bpDNALadder：Lane5PCRproductofswine．derivedCmurls；Lane6PCRproductofbovine·derivedCryptosporidium：2隐孢子虫动物模型的建立21隐孢子虫卵囊的分离与纯化经过1：2蔗糖溶液离心后，在该糖液与样品液之间形成一条带，带中含有大量卵囊及杂质。这是因为所用蔗糖溶液的比重大，可将部分杂质浮在液面，致使卵囊层出现杂质；经过1：3的蔗糖溶液离心后，在该糖液与样品液之间形成一层乳白色的条带，带中含有大量卵囊及少量杂质，管底为杂质。经过1：3．5与1：5的蔗糖溶液离心后，在蔗糖液之间出现一条乳白色条带，内含卵囊及极少量杂质，且各部分蔗糖液仍很透明，吸取白色液层(即卵囊层)，4℃保存。2小鼠最佳免疫抑制剂量的确定在用DEX进行免疫抑制的3个试验组中，甲组小鼠至第35天未见死亡，仅有轻微临床症状；丙组小鼠在第11天死亡2只，至第14 天全部死亡；乙组小鼠有明显临床症状，在第33天死亡3只，第35天死亡5只，仅剩2只活着的小鼠。丁组(非免疫抑制对照组)小鼠至第35天未出现死亡，亦未见任何临床症状。试验前连续3天和试验期间每天对以上4组小鼠粪便进行隐孢子虫卵囊检测，结果均未发现隐孢子虫卵囊。试验组和对照组相比，可以看出，DEX对小鼠具有一定免疫抑制效果。综合考虑甲、乙、丙组小鼠的存活时间长短和临床症状等，我们确定20日龄昆明系小鼠以1．0rag／100mLDEX剂量是最佳免疫抑制剂量。23人工感染小鼠试验结果231免疫抑制接种组小鼠排出卵囊情况免疫抑制接种C．muris卵囊的A组小鼠粪便中排出隐孢子虫卵囊的情况，如图6所示。10000坚80(30V6000鼎剿4000圣2000”0l59131721252933接种后天数(天)图6A组小鼠C．muris卵囊排出情况Fig6CountingofC．murisoocystssheddingofAgroupmice从图6可以看出，在接种C．muris卵囊后次日，即可从A组小鼠粪便中检测出少量C．muris卵囊，此后总的趋势是卵囊排出量逐渐增加，至第8天进入排卵囊高峰期并维持于高水平，持续于整个实验期。在第29天A组小鼠死亡2只，在第30天死亡7只，在第33天A组小鼠全部死亡。免疫抑制接种C．parvum卵囊的B组小鼠粪便中排出隐孢子虫卵囊情况，见图7。 10000坚8000磊6000型4000翼2000Ol59L3L72l252933接种后天数(天)图7B组小鼠C．parvum卵囊排出情况Fig7CountingofC．parvumoocystssheddingofBgroupmice从图7可以看出，在接种C．parvum卵囊后次日，即可从B组小鼠粪便中检测出C．parvum卵囊，在第7天进入排卵囊高峰期，持续于整个实验期。在第24天小鼠死亡1只，在第25天小鼠死亡4只，在第27天小鼠死亡4只，在第29天试验鼠全部死亡。从图6、7可以看出，两组小鼠隐孢子虫卵囊排出情况均呈明显的间歇性，每隔1～2天为一个高峰期，其中B组小鼠两次排出隐孢子虫卵囊高峰期间歇的时间短于A组。B组进入排卵囊高峰期的时间比A组早】天，且B组小鼠比A组小鼠全部死亡时间旱4天。23．2非免疫抑制接种组小鼠排出卵囊情况率免疫抑制接种C．muris卵囊的C组和非免疫抑制接种C．parvum卵囊的D组，仅在接种卵囊后2～3天内分别从粪便中检出少量Cmuris和C．porvum，从第4天至试验结束均未检出隐孢子虫卵囊，且两组小鼠饮、食欲等无明显变化，亦未出现明显临床症状，生长发育正常，排出的粪便硬度适中，无腹泻迹象。233对照组小鼠隐孢予虫卵囊排出情况E组(免疫抑制对照组)和F组(非免疫抑制对照组)两组小鼠，连续35天均未从粪便中检出隐孢子虫卵囊。E组小鼠发育延缓，个体小、精神差，在第33天死亡3只，第35天死亡4只，仅剩3只活着的小鼠。F组小鼠未见任何临床症状，亦未出现死亡现象。234人工感染隐孢子虫小鼠症状和病理变化免疫抑制接种组小鼠予接种后第3天被毛竖立，光泽消失，呆伏巢中，排粪增多，粪便较潮湿，颗粒变大，腹胀，但未见到腹泻症状。 B组小鼠腹胀程度比A组小鼠严重，在试验末期，可明显看出A组小鼠个体大于B组小鼠。剖杀时发现A组小鼠胃壁变薄，B组小鼠肠壁变薄透亮，肠管肿胀，肠道内容物较软，但未见小鼠胃肠道有出血、溃疡等。其它器官未发现明显病变。非免疫抑制接种组小鼠除试验开始头3天出现明显的食欲减退、精神抑郁外，从试验第4天以后，小鼠粪便、饮欲和精神等无明显变化，亦无腹胀症状，在试验末期，小鼠个体大小与非免疫抑制对照组小鼠基本一致。从而说明，隐孢子虫对小鼠有一定的致病作用，且C．parvum比C．muris致病性强，这一结论与有关报道是一致的【1,521。2．3．5小鼠体内隐孢子虫种类鉴定A组和B组小鼠粪便中排出的卵囊大小、形态与各自接种的卵囊基本相同，随机测量A组和B组小鼠粪便中卵囊各50个。A组卵囊的大小为6．5～7．6um×5．1～5．7um，平均为(7．04±0．28)p．m×(5．37±0．17)p．m，形状指数为1．25～1．36，平均为1．3l，初步鉴定为C．muris。见图8。B组卵囊的大小为3．7～5．4¨m×3．6～4．8p,m，平均为(4．56±050)¨m×(4．17±O．41)“m，形状指数为1．03～1．15，平均为1．09，初步鉴定为C．parvum。以上结果表明猪源隐孢子虫的小鼠模型建立成功。见图9。图8不连续蔗糖密度梯度离心法(鼠隐孢子虫，2200×)箭头所指为卵囊Fig．8MicroscopyofCmurisoocystsconcentratedbydiscontinuoussucrosegradients39 图9不连续蔗糖密度梯度离心法(小隐孢子虫，2200×)箭头所指为卵囊Fig．9MicroscopyofC．parvumoocystsconcentratedbydiscontinuoussucrosegradients 讨论l安徽省猪隐孢予虫感染情况及分布特点本次采曩痰愿学方法共捡测了安徽省11个县、枣739头猪的粪榉，结果在除宣州市以外的10个县、市猪粪样中均检出了隐孢子虫卵囊，提示其周围更广泛的地区可能也有该虫的存在，表明安徽省猪的隐孢子虫感染较普遍。在宣州市猪体内来检出隐孢子虫，箕原因可能是该市调研点位于群山之中，远离主要公路，交通极为不便，且村民多为敬藩，溺对该缝区农户重褫锭养管遴，猪禽卫生条律较鲟。晟台昙猪隐孢子虫感染率最高，且感染强度相对较大，可能是由于该县调研点凑交遂予线较遮，入鞠奎禽漉动性较大，基当遗猪舍较麓隧、键养管理和卫生条件均较差。因此，猪隐孢子虫感染可能与猪余的地溅位置、卫生条侈靼饲棼管理水乎套关。在隐孢子嫩阳性猪中，感染强胰较低的猪居移。在聚用金胺酚一改良抗酸染色法粼为强燃的20l头猪中，只蠢12头感染强度较惠(+++、十+++)；在采用饱和白糖溶液漂浮法判为阳性的198头猪中，感染强度为++和十++的分别有14头和6头，来发现感染强度为十+十+的猪。调查中还发璇，当猪感染C．parvum的强度达十十++(金胺酚．改良抗酸染色法)或++十(饱和白糖溶液漂浮法)时，出现体形偏瘦，粪便稀软甚至黢泻：猿感染C．muris溢床症状不臻驻。这楚否因灸C．parvum磁C．muris对猪的致病性强，还有待进一步研究。对不同这嚣猪憋穗子虫感染率送行琵较，发璇我省淮兹缝嚣猪隐孢子虫感染率明显高于江淮之间和皖南山区。可能是由于隐孢子虫的懿主特努犍不十分严穆，在灏一纲蠹不弱旗物之潮霹撼曩接疆，灌j￡地区有牛、猪、羊等阍圈饲养的习惯，且圈舍简陋，狗、猫、鼠等可以自由遴出猪会，这榉就造成了多爨主的隐孢子焱在这数动物瀚传播。同时，广大淮jE地区雾为平原，交通便利，人口密集、饲养管理水平较低、卫生条件较差。这些因素导散了淮北地区猪隐孢子虫感染率较离。雨我省江淮之闻多为丘陵遣形，皖南多为由送，交通裙辩不便，树落规模一般较小，许多村落与外界的联系仅为窄小的土路，同时，这些遣送靛农户琵较注重镯葵管理、猿舍里生条纬较鲟、家畜豢禽混养的现豫比较少见等等，这然都不利于病原体的传播。4l 凋研结果表明，猪隐孢予虫感染率与猪的年龄有一定的相关性，而且年龄越小临床症状越明显。在三个年龄段r|1，4月龄以内仔猪感染率明显高于其它年龄段的猪。这与蒋金书等fl531、张龙现等【52J报道的结果基本吻合。提示这个年龄段的猪可能是最危险的传染源，应重视对这一年龄段猪的管理。上述12头高强度感染猪中，6头猪的年龄在2月龄以内，5头猪的年龄在1年以上，只有一头猪的年龄为7月龄，由此可推断低龄猪或1年以上猪隐孢予虫感染强度高的可能性较大。原因可能是由于一年以上的猪多为母猪，母猪妊娠或哺乳期间，免疫力下降而致使其感染强度增高；至于低龄猪感染强度高的原因，可能是由于机体免疫机能尚未发育完全的缘故。对凤台县不同性别猪隐孢子虫感染率进行统计分析，结果公、母猪感染率间差异不显著，说明猪隐孢子虫感染率与性别无关。这与有关资料的报道是一致的15“。调研中还发现，猪场的猪隐孢予虫感染率较农户散养的猪低。这可能是由于农户养猪投入不够，不太注重饲养管理，猪饲料不全价，卫生条件较差。合肥5个猪场l87头猪的粪样，经金胺酚．改良抗酸染色法只检出12例阳性猪，感染率仅为6．42％，而在风台县农户散养的112头猪中，阳性猪为63头，阳性率为56．25％。据采集粪样时实地调查，多数猪场管理严格，对外来人员、车辆的出入、饲料的购入等均制定了，一套相应的防范措施，管理较规范、猪的膘情良好，且猪场多僻处郊外，远离居民区，离主要交通干线干米丌外。基于上述原因，猪场的猪隐孢子虫感染率低于农户敞养猪。2PCR方法在猪粪便隐孢子虫检测中的应用Laxeretat(1991)¨“1首次将PCR方法用于检测人粪便中C．parvum，为建立敏感性高、特异性强的隐孢予虫病诊断方法开辟了新途径。国内医学界和兽医学界把PCR技术应用于隐孢子虫研究的报道较少，仅马良等(1996)【。241和郭步平等(1998)tⅢ1分别应用该方法对人和实验动物粪便中隐孢子虫进行检测，李培英等(1999)I”ol应用该方法对奶牛粪便中隐孢子虫进行检测，至今尚未见应用PCR方法检测猪粪便中隐孢予虫的报道。本研究在国内首次把PCR技术应用于猪粪便中隐孢子虫的检测。在模板DNA制备方法上，文献报道的方法很多1125，Ⅲ，Ⅲ1。一般的步骤为：首先从粪便标本中分离纯化卵囊，接着抽提模板DNA。在本实验中，我们采用Sheather’S蔗糖漂浮法浓缩卵囊和液氮冻融破碎虫体的：疗法制备模板DNA，这种模板DNA混杂有肠道微生物、其它寄 ，E虫、食物残渣以及宿主体细胞的DNA等杂质，纯度不高，但是简化了实验操作步骤，粪样中隐孢子虫卵囊的DNA损失大大降低，实验证明，该模板用于PCR反应是可行的，并使过程简化，检测更快速。由于猪体内可寄生C．muris和C．parvum，本实验使用的引物具有隐孢子虫属特异性，所以能同时检测猪体内的C．muris和C．parvum，以该引物进行PCR，可用于对人、牛和猪等哺乳动物隐孢子虫病的诊断和流行病学调查。但由于该引物不具有种特异性，要从分子水平进行虫种鉴定，探知各不同地理株隐孢子虫之间是否存在基因差异，等等，则还需重新设计和合成具有隐孢子虫种特异性的引物和利用其它现代分子生物学技术进行更深入的研究。目前隐孢子虫病的诊断主要依靠病原学方法查找隐孢子虫卵囊。但病原学方法操作繁琐，费时费力，大规模流行病学调查时工作量太大。采用病原学方法检测隐孢子虫卵囊的检测闽值为5×104个／克【l241，低于这个数量则容易漏检。PCR技术是近年发展起来的一种体外扩增特异陛DNA的技术，以其准确、高度敏感与高度特异等优点越来越多地被直用于隐孢子虫病的诊断和流行病学调查中。用PCR可以检测含卵囊400个／mL的样品【”“，比目前病原学方法至少灵敏100倍。本研究结果也表明，PCR方法检测隐孢子虫敏感性高，这对于亚临床感染动物卵囊稀少的粪便标本以及水源、食品标本的检测，不失为一种有效的检测方法。3免疫抑制药物及其剂量与动物模型建立的关系据资料报道(”41，隐孢子虫易感与否和实验动物免疫功能状况有密切的关系。免疫功能正常的动物不易感染隐孢子虫，即使感染，其排出卵囊时间短，粪便中卵囊数量少。所以，建立动物模型首先要使用免疫抑制剂损伤或降低实验动物的免疫功能。目前国内外使用的免疫抑制削有地塞米松(DEX)、地塞米松磷酸盐(DEXp)、醋酸可的松和FK一506等，不同剂型的药物要求相应的给药方式。根据操作简便、来源方便的原则，目前应用最多的是地塞米松(DEX)，给药途径主要有皮下注射、肌肉注射、灌胃和饮水等四种方式。由于采用饮水方式抑制实验动物免疫功能的方法具有操作简便、安全、对实验动物应激小等优点，越来越受到国内外学者的青睐。蒋金书用DEX(1mg／L)饮水免疫抑制小鼠供牛源隐孢子虫卵囊人工感染，Rehg(1990)连续10天应用DEX(0．25mg／kg体重)饮水免疫抑制大鼠供牛源隐孢子虫卵囊感染均获得满意效果[140l。43 据报道，猕猴‘451、幼犬1155】、家兔[156I、鸡[140J和鼠141,157．158】等均可作为隐孢子虫动物模型实验动物。根据选用的实验动物要对隐孢子虫易感、便宜、对外界不良环境抵抗力强，来源、饲养、操作、材料处理方便等方面综合考虑，我们认为鼠是比较理想的隐孢子虫动物模型实验动物。已有许多学者建立了以不同品系小鼠‘125’”4，¨6l作为实验动物的隐孢子虫动物模型，结果表明隐孢子虫动物模型的建立，不仅与使用的试验鼠品系有关，而且不同品系鼠需要的免疫抑制剂量和免疫抑制时间不同。苏庆平等f1992)[”41发现，在同是免疫功能受抑制情况下，(’．parvum对小白鼠的易感性明显高于对地鼠的易感性；史长松等f1998)【157l采用DEX2mg／kg·d灌喂2月龄sD大鼠，第8天接种隐孢子虫卵囊：宁长申等(1997)[1581使用1月龄昆明系小鼠，每只小鼠口服DEX5mg，同时接种隐孢子虫卵囊；等等。本实验室分别尝试过使用45日龄、75曰龄的昆明系小鼠作为隐孢子虫动物模型实验动物，结果发现试验鼠日龄越小，成功建立动物模型的可能性越大。原因可能是日龄：t的试验鼠机体免疫功能已经完善，外因不易破坏机体的免疫系统，对损伤的免疫系统修复能力强。从以上可以看出，采用不同免疫抑制方式、剂量的DEX使不同日龄、不同品系的试验鼠达到免疫抑制状态所需要的时间不同。在建立动物模型过程中，免疫抑制剂量和免疫抑制时间是动物模型能否建立成功的关键。根据有关文献资料，结合本实验室具体情况，我们分别用05、l0和1．5rag／100mL三种DEX免疫抑制剂量进行小鼠最佳免疫抑制剂量筛选试验，结果05rag／100mL组的临床症状变化不明显，而l5mg／100mL组试验鼠存活时间较短，实际工作中应用意义不大，根据小鼠存活时间的长短和临床症状等，我们认为20日龄昆明系小鼠以10mg／100mLDEX剂量是最佳免疫抑制剂量。4猪源隐孢子虫动物模型的建立；F连续蔗糖密度梯度离心法在隐孢子虫研究中居于十分重要的地位。在本研究中，我们应用该方法分离纯化的卵囊建立了隐孢子虫动物模型。结果表明，纯化的卵囊不仅杂质少，容易计数。而且操作过程对卵囊的损伤很小，卵囊仍具有感染性。因此，在隐孢子虫研究中，多数学者应用该方法分离纯化卵囊。通过对A、B组试验鼠排出隐孢子虫卵囊情况的比较，可以看出B组小鼠排卵囊高峰期出现早，两次高峰之间间隔时间短，试验鼠死亡时间早等，能否得出猪源C．parvum的致病性比猪源C．muris强的结论， 还需进一步证实。卵囊排出的间歇性可能是由于一部分合子形成薄壁卵囊，不随粪便排出，而造成自身循环感染，循环感染的周期约为l～2天，经过一个完整的发育周期，卵囊排出量出现一个高峰。这可能也是即使少量隐孢子虫感染也会造成严重危害的原因。据资料记载，将近20％的接种鼠即使只有一个卵囊也表现明显的感染[1591，经过裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三个阶段，数量上呈几何指数增加，通过粪便排出大量卵囊。但在实际操作中，考虑到实验动物的唾液、胃酸等不良因素对隐孢子虫卵囊的破坏以及实验动物自身所处的免疫状态等，在建立隐孢子虫动物模型时，接种卵囊数应尽量多一些。在接种相同数量隐孢子虫卵囊的情况下，免疫抑制接种组小鼠人工接种卵囊后的潜伏期约为48h，比Currentetat(1986)¨60l报道的隐孢子虫在小鼠体内一个完整发育周期72h的时间短，分析原因可能与接种隐孢子虫卵囊数量较多有关。从第1次排卵囊高峰期开始至试验鼠死亡，小鼠持续排出大量卵囊，卵囊大小及形态特征与接种的猪源隐孢子虫基本相同；而非免疫抑制接种组小鼠只是从接种卵囊后2～3天内的粪便中排出少量隐孢子虫卵囊，以后粪检始终呈阴性。出现以上结果的原因可能是由于DEX可抑制试验鼠的免疫功能，在整个试验期间，免疫抑制接种组一直饮用含有DEX的蒸馏水而造成自身免疫系统功能部分或完全丧失且不能及时恢复，所以能稳定且持续排出大量卵囊，表明人工感染的隐孢子虫卵囊己在猪体内定殖并发育繁殖。非免疫抑制接种组小鼠由于自身免疫系统未受损害，能有效抵抗和清除隐孢子虫卵囊感染，试验初期从粪样中检出的卵囊是人工接种后未在猪体内定殖的猪源隐孢子虫卵囊。可见，免疫系统在抗隐孢子虫感染过程中起着非常重要的作用。这可部分解释该虫对免疫力暂时下降的待产母猪、哺乳期母猪，免疫力缺陷的化疗患者、器官移植患者、艾滋病人，以及免疫功能尚不健全的婴幼儿易感的原因。免疫抑制对照组小鼠连续35天粪检，结果始终呈阴性，说明试验鼠群无自然感染隐孢子虫现象，进一步证实免疫抑制接种组小鼠粪便中排出的隐孢子虫卵囊是猪源隐孢子虫在鼠体内定殖并发育增殖所致。免疫抑制接种组小鼠的体重下降，这是由于小鼠感染隐孢子虫后，它一般寄生于胃、小肠引起消化吸收功能下降，影响了小鼠的生长和发育，从而造成它的生长缓慢或停滞。蒋金书等(1989)[”l、宁长申等(1997)t”81通过人工感染试验证明牛源隐孢子虫能够感染免疫力正常和免疫力下降的小鼠，而在本试验中，从猪体内分离的隐孢子虫仅能感染免疫力下降的小鼠，不能感染免疫45 力正常的小鼠，是否可以得出牛源隐孢子虫的致病力比猪源隐孢子虫强的结论，还有待于进一步研究。试验鼠的粪便散落于鼠笼垫料中，把粪便从垫料中拣出的步骤费时、费力。我们应用自制的鼠粪收集筛收集小鼠的粪便，省时、省力且收集率高，大大提高了实验效率。本试验应用猪源隐孢子虫卵囊成功地建立动物模型的事实，证实了从猪体内分离的隐孢子虫卵囊可以感染小鼠，即隐孢子虫可以在猪和鼠之间进行传播。提示在广大农村和猪场预防本病，应重视灭鼠。 结论I采用金胺酚．改良抗酸染色法和饱和白糖溶液漂浮法对安徽衡猪隐您子蠢感染谤浇逶行了检测，掰获宝俸缀形态掌鉴定为鼠隐猿子虫(Cryptosporidiummuris)和小隐獭子虫(CryptosporMiumparvttm)。跌猿传癌分离壅omuris郭C，parvum在安皴遴瑟蓠次。2根据隐孢予虫srDNA的基因序列，合成隐孢子虫属特异性引物。以安徽猪源C．muris髓C。parvum的DNA为摸扳，与隐斑予虫耀特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增出540bp的特异片段，从分子水平证实安徽省猪{本内存在隐魄子虫瘸原。3用猪源隐孢子虫(C．muris和C．parvum)建立了动铭(小鬣)模型。人工感染试验表明，必须在免疫抑制状态下(DEX1．0rag／100mI，)，隐氇予擞才髓在小鼠体疼定薅并完成其生灞受。4猪隐袍子虫病流行病学研究结果为人裔共患隐孢予呶瘸的防治提供了理论菝攥。薮建立兹猿源隐穗子虫动锈摸黧走戆建子虫懿生软化学、免疫学及隐孢子虫病的治疗簿方面的研究奠定了熬础。 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致谢本论文整个工作是在导师李培荚教授和余为一教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、实验设计到论文的最后完成无不浸透著导洚秘大蚤心血和汗水。导烽严谨的学鼠、渊博的知识、谦和的态度、对事业的热枕和追求，以及对学生的霹心和高度责任惑，使我终点受益。在学习期间，导9币还在思想上给予教诲、生活上给予无微不至的关怀和帮助。在此，向导师致以崇高的敬意。在实验过程中得到魏建忠副教授、李槿年教授的热情指导和关怀，同时王桂军老师、魏梅芳老师和严若峰博士给予了大力支持，还得藿《了陈灵芝、李五英、簿松暴、李秣、李叶、朱启运、何长生、陈光明、胡守奎、刘玉华和许发芝以及本矮士点秘全傣跨兄妹们酶大力帮动。三年来，一直得到富牧水产学院和研究生处的领导和老耀的照顾争美心，转向纯们表示感臻。值此论文付梓之际，我特别要向中国衣科院上海家畜寄生虫病研究所锥虫组的属金林、周勇志、龚海燕等老烽表示衷心的谢意，感谢他们给予的荚心与帮助。最后，向三年来，关心和支持过我的澎师、同学及友人致以最诚挚的谢意! 作者简介赵长城，男，1975年生于安徽省淮北市，194年考入安徽农业大学动物医学系，1996--1997、197—1998年获安徽农业大学畜牧水产学院“优秀团员”称号，198．7—200．9，工作于淮北矿务局芦岭煤矿生活科，因工作能力突出和思想素质过硬，光荣加入中国共产党，200．9一，就读于安徽农业大学预防兽医学硕士点。研究生学习期间，完成99级动物医学专业微生物与免疫学、兽医寄生虫学实验课的教学工作，协助导师完成省自然科学基金资助的课题(项目编号01041204)，发表论文四篇。附发表论文以第一作者身份发表论文两篇：1安徽省凤台县猪隐孢子虫病流行病学调查[J]．中国兽医寄生虫病，203(1)：42～442鸡大肝大脾病研究进展[J]．养禽与禽病防治，2001(9)：20～21与他人合作发表论文两篇：3凤台县猪球虫种类及感染情况调查[J]．中国兽医寄生虫病，202(3)：25～274风台县黄牛消化系统寄生虫初步调查[J】．安徽农业科学，2002(10)：236—237