猪用生物发酵床垫料中微生物群落多样性变化及芽孢杆菌分离与鉴定

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1、华中农业大学硕士学位论文猪用生物发酵床垫料中微生物群落多样性变化及芽孢杆菌分离与鉴定姓名：王迪申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：邓昌彦201206猪用生物发酵床垫料中微生物群落多样性变化及芽孢杆菌分离与鉴定摘要随着规模化养猪所占比例迅猛增加，带来的环境污染成为一个亟待解决的新问题。生物发酵床养猪技术通过在垫料中原位消纳生猪的排泄物，从而有效解决生猪生产带来的环境污染问题。生物发酵床养猪技术的核心是垫料中微生物群落的活动，因此，生物发酵床微生物优势茵的选育及微生物多样性成为近年来研究的热点。本试验

2、采用纯培养法筛选高效芽孢杆菌及运用DGGE技术对猪用生物发酵床垫料中微生物群落多样性变化进行研究，结果如下：l高效芽孢杆菌的筛选与鉴定(1)通过对茵落形状、表面光滑度、边缘形状、颜色、透明度等形态特征的识别，从发酵床样品中纯化分离了15株芽孢杆菌。(2)对分离的15株芽孢杆菌进行产淀粉酶和蛋白酶检测，筛选出5株产淀粉酶和蛋白酶能力都强的芽孢杆菌。(3)通过对这5株高效芽孢杆菌进行传统的菌落形态观察、革兰氏染色、芽孢染色和生理生化鉴定，结合16SrRNA分子生物学鉴定。可以确定分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillusc

3、ereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。2DGGE分子生物学分析(1)提取微生物总基因组DNA，进行16SrRNA基因V6"～V8区进行PCR扩增。通过对DGGE垂直梯度凝胶图谱的分析计算和多次试验调整，确定DGGE平行胶的变性剂浓度范围为45％--一65％后进行平行DGGE得到保育期和育成期的生物发酵床

4、样品细菌DGGE图谱。(2)通过QuantityOne软件分析DGGE图谱发现：a保育期各年限、各厚度和各层次的样品细菌DGGE图谱中条带丰富度明显高于育成期样品；b保育期和育成期中二年期样品在各自厚度样品中的细菌多样性较高；c相同猪只饲养阶段和垫料使用年限的各层次之间的细菌多样性差异较小；d保育期浅层和深层生物发酵床之间的细菌多样性差异较小。(3)进行条带回收克隆测序发现：a在生物发酵床中存在大量未被或难被分离培养的微生物，这些微生物存在也发挥着一定作用，有待进一步认知；b虽然检测到不少条件致病菌(如：Esch

5、erichiacolistrain)，但是在这些发酵床上饲养的猪只发华中农业大学2012届硕士研究生学位论文病率并不高，这可能得益于其他有益微生物的拮抗作用和猪只自身免疫力较高的原因；c对猪粪降解可能起关键作用的细菌和放线菌，如Bacillussubtilis；d一株在高盐的环境可以生存的细菌Salinicolasalariusstrain；e菌株Dyellaterraestrain对生物发酵床中铜离子进行吸附和积累，从而去除其中存留的重金属污染。关键词：生物发酵床；芽孢杆菌：DGGE；16SrRNA基因；多样性

6、II猪用生物发酵床垫料中微生物群落多样性变化及芽孢杆菌分离与鉴定ABSTRACTWiththerapidincreaseintheproportionoflarge-scalepig，thenewproblemsthatbringenvironmentalpollutionhavebecomeanurgentneedtosolve．Byinsitufermentationofpigexcrementinthelitter，deep-littersystemcaneffectivelysolvetheproblem

7、ofenvironmentalpollutionthatcausedbypigproduction．Thekeytechnologyofdeep—littersystemisactivityofmicrobialcommunitiesinthelitter，SOdominantbacteriumofdeep—littersysteminthelitterandthemicrobialcommunitydiversitybecomeresearchhotspotsinrecentyears．Inthisstudy，

8、efficientbacillusstrainswereisolatedbyusingpureculturingmethodsandthemicrobialcommunitydiversitywerestudiedbydenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)．Theresultsarelistedasfollows：1Theis